Insulina

Mar 15, 2024

Nature volumen 614, páginas 118–124 (2023)Cite este artículo

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La diabetes representa un espectro de enfermedades en las que la disfunción metabólica daña múltiples sistemas orgánicos, incluidos el hígado, los riñones y los nervios periféricos1,2. Aunque la aparición y progresión de estas comorbilidades están relacionadas con la resistencia a la insulina, la hiperglucemia y la dislipidemia3,4,5,6,7, el metabolismo aberrante de los aminoácidos no esenciales (NEAA) también contribuye a la patogénesis de la diabetes8,9,10. La serina y la glicina son NEAA estrechamente relacionados cuyos niveles se reducen constantemente en pacientes con síndrome metabólico10,11,12,13,14, pero los impulsores mecanicistas y las consecuencias posteriores de este metabotipo aún no están claros. Los niveles bajos de serina y glicina sistémicas también están emergiendo como un sello distintivo de los trastornos maculares y de los nervios periféricos, correlacionándose con deterioro de la agudeza visual y neuropatía periférica15,16. Aquí demostramos que la homeostasis aberrante de la serina impulsa las deficiencias de serina y glicina en ratones diabéticos, que pueden diagnosticarse con una prueba de tolerancia a la serina que cuantifica la absorción y eliminación de serina. La imitación de estas alteraciones metabólicas en ratones jóvenes mediante la restricción de serina o glicina en la dieta junto con una ingesta elevada de grasas acelera notablemente la aparición de neuropatía de fibras pequeñas al tiempo que reduce la adiposidad. La normalización de la serina mediante suplementos dietéticos y la mitigación de la dislipidemia con miriocina alivian la neuropatía en ratones diabéticos, vinculando la neuropatía periférica asociada a la serina con el metabolismo de los esfingolípidos. Estos hallazgos identifican la deficiencia sistémica de serina y la dislipidemia como nuevos factores de riesgo de neuropatía periférica que pueden explotarse terapéuticamente.

Para explorar cómo la obesidad y la diabetes influyen en el metabolismo de la serina, la glicina y el carbono único (SGOC), cuantificamos la serina, la glicina y la metionina en los tejidos en un modelo de ratón establecido de obesidad mórbida, resistencia a la insulina e hiperglucemia (ratones db/db deficientes en el receptor de leptina). sobre un fondo negro Kaliss (BKS-db/db)) y compararon los resultados con controles C57BL/6J de tipo salvaje de la misma edad. Los ratones db/db mostraron reducciones de alrededor del 30% en los niveles de serina hepática y renal en relación con los ratones de tipo salvaje (Fig. 1a y Datos ampliados, Fig. 1a), y las reservas de glicina más abundantes se redujeron entre un 30% y un 50% en el hígado. , riñón, tejido adiposo blanco inguinal (iWAT) y plasma (Fig. 1a y Datos ampliados Fig. 1a-c). La metionina está vinculada a la serina a través del metabolismo de un carbono y también se redujo en el hígado, iWAT y plasma (Fig. 1a y Datos ampliados Fig. 1b, c), lo que sugiere que la diabetes disminuye los niveles de serina y glicina en los tejidos que son importantes para la glucosa. y homeostasis lipídica.

a, Niveles de glicina, serina y metionina en el hígado de ratones de tipo salvaje y BKS-db/db después de un ayuno de 6 h (n = 6 por grupo). b, Esquema de las vías biosintéticas y catabólicas de serina y glicina. Los genes hepáticos regulados positivamente en ratones BKS-db/db están en violeta, y los genes regulados negativamente están en azul. 10-formilTHF, 10-formiltetrahidrofolato; 3-PG, 3-fosfoglicerato; 5,10-meTHF, 5,10-metilenetetrahidrofolato; dTMP, monofosfato de desoxitimidina; f-Met, N-formilmetionina; PEP, fosfoenol piruvato; TCA, ácido tricarboxílico; THF, tetrahidrofolato. c, expresión de ARNm de genes de enzimas hepáticas que regulan el metabolismo de SGOC en ratones de tipo salvaje y BKS-db/db (n = 6 por grupo). d, Fracción marcadora de serina, glucosa, glicina y metionina en plasma (1 - M0) en ratones de tipo salvaje a los que se les administró serina [U-13C3] mediante sonda oral después de un ayuno nocturno (n = 4 por punto temporal). e, Fracción de etiquetado de glicina tisular en ratones de tipo salvaje 15 minutos después de la administración de [U-13C3]serina mediante sonda oral (n = 4 por tejido) después de un ayuno nocturno. f, Fracción de marcado de piruvato tisular en ratones de tipo salvaje 15 minutos después de la administración de [U-13C3]serina mediante sonda oral (n = 4 por tejido) después de un ayuno nocturno. g, OGTT y STT combinados en ratones de tipo salvaje y BKS-db/db (n = 6 por grupo) después de un ayuno nocturno. h, STT AUC en ratones de tipo salvaje y BKS-db/db (n = 6 por grupo). i, OGTT y STT combinados en ratones C57BL/6J tratados con vehículo (n = 7) y STZ (n = 6) después de un ayuno nocturno. j, STT AUC en ratones C57BL/6J tratados con vehículo (n = 7) y STZ (n = 6). Los datos son media ± sem y se analizaron mediante la prueba t independiente bilateral (a,c,h,j) y ANOVA bidireccional con la prueba post hoc de diferencia menos significativa de Fisher (g,i). El esquema de la Fig. 1b se preparó en BioRender.

Los mamíferos obtienen serina de la dieta, síntesis de novo a partir de glucosa y mediante glicina y metabolismo de un carbono, siendo el hígado y el riñón los principales sitios para el metabolismo posprandial de NEAA (Fig. 1b). Para comprender mejor la base mecanicista de la serina y glicina hepáticas reducidas en ratones db / db, cuantificamos la expresión de genes asociados con el metabolismo de SGOC después de un ayuno de 6 h (Fig. 1c). Los genes que codifican enzimas clave responsables del catabolismo o eliminación de serina y unidades de un carbono estaban significativamente regulados positivamente en ratones db/db, incluida la serina deshidratasa (Sds), la serina hidroximetiltransferasa 1 (Shmt1), Shmt2 y la 10-formiltetrahidrofolato deshidrogenasa (Aldh1l1). La expresión de dos genes que codifican componentes del sistema de escisión de glicina (glicina descarboxilasa (Gldc) y dihidrolipoamida deshidrogenasa (Dld)) aumentó en el hígado db/db, mientras que la expresión de 3-fosfoglicerato deshidrogenasa (Phgdh) y metilentetrahidrofolato deshidrogenasa 2 (Mthfd2) ) se redujeron significativamente, lo que indica que la síntesis de novo serina también puede estar limitada en ratones diabéticos. Estos resultados son consistentes con el modelado metabólico a escala genómica de datos de transcripción del hígado de diabéticos humanos17. El riñón es otro centro para el metabolismo de SGOC y la expresión renal de Shmt1 y varios genes que codifican enzimas asociadas con el metabolismo de un carbono aumentaron en ratones db/db (Datos ampliados, figura 1d).

Las variaciones circadianas y posprandiales de los aminoácidos y la glucosa dificultan el diagnóstico de defectos metabólicos. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que una "prueba de tolerancia a la serina" (STT) podría evaluar mejor el metabolismo de SGOC en ratones e identificar aquellos con una elevada eliminación de serina. Aplicando dosis similares a las utilizadas en ensayos clínicos en humanos (ClinicalTrials.gov: NCT03062449) (400 mg kg-1), administramos serina por vía oral a ratones de tipo salvaje en ayunas durante la noche y cuantificamos la farmacocinética de la serina plasmática para medir la dinámica del aclaramiento de serina. con niveles que regresan al valor inicial en aproximadamente 2 h (Datos ampliados, Fig. 1e). Para identificar las principales vías involucradas en la eliminación de serina, administramos por vía oral serina [U-13C3] a ratones de tipo salvaje en ayunas durante la noche y cuantificamos el enriquecimiento de los metabolitos posteriores. Observamos que la glucosa se marcó en un grado similar a la glicina durante toda la prueba (Fig. 1d), y el carbono derivado de serina [U-13C3] se incorporó significativamente en los grupos de glicina, piruvato y citrato hepáticos (Fig. 1e, f y Extendido). Datos Fig. 1f, g), lo que demuestra que la gluconeogénesis hepática es una vía importante para la eliminación de serina en algunos contextos y vincula su regulación con la insulina y el glucagón, ambos elevados en ratones db / db (Datos ampliados, Fig. 2a-c). Para probar si la resistencia a la insulina afecta la absorción y eliminación de serina, administramos glucosa (2 g kg-1) y serina (400 mg kg-1) a ratones de tipo salvaje y db/db en ayunas durante la noche. Observamos una reducción significativa en el área bajo la curva (AUC) de STT en ratones db/db (Fig. 1g, hy Datos ampliados Fig. 2d), a pesar de la dosis más alta administrada. En particular, la exposición aguda a serina esencialmente no tuvo ningún efecto sobre las concentraciones de glicina circulante (Datos ampliados, Fig. 2e), a pesar de la evidencia de su rápida interconversión (Fig. 1d, e). Por el contrario, no hubo diferencias en el AUC de STT entre ratones de tipo salvaje y db/db cuando se administró serina sin glucosa (Datos ampliados, figura 2f).

Para determinar si la eliminación elevada de serina es específica de ratones db/db deficientes en el receptor de leptina o es más generalmente atribuible a una alteración de la señalización de la insulina, tratamos ratones C57BL/6J con vehículo o estreptozotocina (STZ) para inducir deficiencia de insulina, hiperglucemia y pérdida de grasa. Datos ampliados Fig. 2g – i). La glicina plasmática y los aminoácidos de cadena ramificada (pero no la serina) se alteraron una semana después del tratamiento con STZ (Datos ampliados, figura 2j). Dos semanas después de la inyección, la administración conjunta de glucosa y serina reveló una eliminación elevada de serina en ratones diabéticos con STZ en relación con los controles (Fig. 1i, j y Datos ampliados Fig. 2k), lo que sugiere que la resistencia o deficiencia de insulina pueden contribuir a una reducción de la circulación. serina en ratones diabéticos.

Los estudios clínicos han implicado la deficiencia de serina en la regulación de la enfermedad macular y la neuropatía periférica15,16. Dada la alteración de la homeostasis de la serina en ratones db/db, a continuación confirmamos que el metabolismo aberrante de la serina coincide con la neuropatía periférica en este modelo. Los ratones db / db de catorce semanas de edad exhibieron hipoalgesia térmica y táctil, así como una disminución de la velocidad de conducción del nervio motor (MNCV) (Datos ampliados, figuras 2l a n). Estos hallazgos sugieren que la homeostasis aberrante de la serina está asociada con la neuropatía periférica diabética.

La restricción de serina y glicina se utiliza ampliamente para modular los resultados de salud en ratones y es relativamente bien tolerada durante varios meses16,19,20,21,22. Para modelar el efecto de la deficiencia sistémica de serina en el contexto de la obesidad inducida por la dieta, alimentamos a ratones con dietas bajas en grasas (10% kcal) (LFD) o altas en grasas (60% kcal de grasa) (HFD) y comparamos sus fenotipos. a ratones alimentados con dietas isonitrogénicas que carecen de serina y glicina (−SG LFD o −SG HFD) (Tabla complementaria 1). Ambas dietas −SG redujeron efectivamente los contenidos de serina y glicina circulantes y hepáticos durante el estado de alimentación, pero no durante el estado de ayuno (Fig. 2a, b y Datos ampliados Fig. 3a, b). La HFD por sí sola redujo los niveles de glicina en el hígado, pero en menor medida que la serina en la dieta y la abstinencia de glicina (Datos ampliados, figura 3b). Otros metabolitos hepáticos derivados de serina y glicina, incluido el glutatión, no se vieron fuertemente afectados por su restricción (Datos ampliados, figura 3b). Es de destacar que el aumento de peso causado por la HFD se vio atenuado por la restricción de serina y glicina en la dieta, mientras que la ingesta de alimentos, calorías y agua, la absorción de calorías y la actividad física no se vieron afectadas (Fig. 2c y Datos ampliados, Fig. 3c-h). Utilizando imágenes de resonancia magnética ecográfica (echoMRI), cuantificamos las masas magras y grasas en todos los grupos y observamos que la restricción de serina en la dieta redujo significativamente la masa grasa pero no tuvo ningún efecto sobre la masa magra en relación con el grupo HFD (Fig. 2d). De acuerdo con estos cambios en la adiposidad, observamos que la alimentación con HFD aumentó, mientras que la restricción de serina y glicina disminuyó, el tamaño de los adipocitos blancos del epidídimo (Datos ampliados, Fig. 3i).

a, Niveles de serina en plasma en ratones alimentados y en ayunas durante la noche alimentados con LFD, −SG LFD, HFD o −SG HFD durante 18 semanas (n = 10 por grupo). b, Niveles de glicina en plasma en ratones alimentados con LFD, −SG LFD, HFD o −SG HFD durante 18 semanas (n = 10 por grupo). c, Peso corporal de ratones alimentados con LFD, −SG LFD, HFD o −SG HFD (n = 13 por grupo). d, Composición corporal en ratones 18 semanas después de la alimentación con LFD (n = 10), −SG LFD (n = 12), HFD (n = 13) o −SG HFD (n = 13). e, AUC de la prueba de tolerancia a la glucosa (GTT) 18 semanas después de la alimentación con LFD, −SG LFD, HFD o −SG HFD (n = 13 por grupo). f, AUC de la prueba de tolerancia a la insulina (ITT) 18 semanas después de la alimentación con LFD, −SG LFD, HFD o −SG HFD (n = 15 por grupo). g, Diversidad alfa filogenética en ratones alimentados con LFD, −SG LFD, HFD o −SG HFD (n = 10 por grupo). h, fracción logarítmica de especies de la vía de síntesis de ácidos grasos en ratones alimentados con LFD (n = 10), −SG LFD (n = 10), HFD (n = 9) o −SG HFD (n = 9) durante 18 semanas. . i, Síntesis de palmitato hepático de novo en ratones alimentados con LFD (n = 3), −SG LFD (n = 4), HFD (n = 5) o −SG HFD (n = 5) durante 18 semanas. j, Detección térmica en ratones alimentados con LFD (n = 15), −SG LFD (n = 15), HFD (n = 14) o −SG HFD (n = 15 por grupo). Los datos son media ± sem y mínimo y máximo (g, h), y se analizaron mediante ANOVA de dos vías con la prueba post hoc de diferencia menos significativa de Fisher (a – j).

Para determinar cómo la alimentación con −SG HFD influye en la homeostasis de la glucosa, analizamos ratones utilizando GTT e ITT estándar. Mientras que −SG HFD atenuó la obesidad, los ratones permanecieron intolerantes a la glucosa y la insulina (Fig. 2e, f y Datos ampliados Fig. 3j, k), lo que sugiere que la restricción de serina y glicina y la consiguiente reducción de la adiposidad no previenen la intolerancia a la glucosa inducida por HFD. y resistencia a la insulina. Para probar si la utilización alterada del sustrato sistémico de los carbohidratos en lugar de los lípidos estaba impulsando los cambios en la adiposidad, colocamos ratones que habían consumido cada dieta durante 18 semanas en jaulas metabólicas y cuantificamos el índice de intercambio respiratorio (RER). Mientras que la HFD alteró el RER como se esperaba, no se observaron cambios con la restricción de serina/glicina en la dieta (Datos ampliados, figura 3l).

A continuación, realizamos un análisis metagenómico de la microbiota fecal para comprender cómo las dietas anteriores afectaron la composición y diversidad del microbioma, que se correlacionan con las deficiencias dietéticas y pueden amortiguarlas23. La alimentación sostenida con HFD o −SG HFD redujo la diversidad alfa filogenética en relación con los ratones alimentados con LFD, mientras que la alimentación con −SG LFD aumentó la diversidad alfa (Fig. 2g). Por el contrario, las pruebas PERMANOVA de distancias de Aitchison a partir de un análisis robusto de componentes principales revelaron diferencias significativas en la diversidad beta entre ratones alimentados con −SG HFD y otros grupos, destacando el efecto distintivo de esta dieta baja en carbohidratos, alta en grasas, restringida en serina y glicina sobre el microbioma fecal (Datos ampliados, figura 4a). Además, las proporciones logarítmicas de las cepas de microorganismos que expresan la biosíntesis completa de serina y las vías de escisión de glicina aumentaron y disminuyeron, respectivamente, con -SG HFD (Datos extendidos Fig. 4b, c), y esta dieta redujo la proporción logarítmica de las cepas que expresan una biosíntesis completa de serina y las vías de escisión de glicina. Vía de síntesis de ácidos grasos (Fig. 2h). Las cepas clave que muestran las alteraciones más fuertes se enumeran en la figura 4d de datos ampliados. En particular, la alimentación con −SG LFD no moduló las cepas de esta manera, presumiblemente debido al mayor contenido de carbohidratos, lo que podría facilitar la síntesis de serina.

A continuación, para investigar directamente cómo la deficiencia de serina afecta la lipogénesis hepática, a los ratones alimentados con las dietas anteriores durante 18 semanas se les administró agua pesada (D2O) durante 18 h y se extrajeron los lípidos para cuantificar el enriquecimiento de isótopos, la abundancia molar y la síntesis24. La restricción dietética de serina y glicina redujo potentemente la síntesis de palmitato hepático en aproximadamente un 70% en relación con las dietas de control repletas de serina (Fig. 2i y Datos ampliados Fig. 5a). La síntesis de colesterol hepático aumentó en −SG HFD en comparación con HFD (Datos ampliados, figura 5b). De acuerdo con estos cambios, la expresión hepática de ATP-citrato liasa (ACLY), acetil-CoA carboxilasa (ACC2) y estearoil-CoA desaturasa (SCD1) se redujo fuertemente (alrededor del 50 %) mediante la restricción de serina en la dieta, mientras que la expresión de la biosíntesis de colesterol las enzimas no cambiaron o aumentaron (Datos ampliados, figuras 5c-e). Los cambios en la fosforilación de AKT en Ser473 y Thr308 se correlacionaron con el contenido de grasas y carbohidratos de la dieta en lugar de con los niveles de serina y glicina, lo que sugiere además que la restricción de serina impulsa cambios en el metabolismo de los ácidos grasos que son independientes de la señalización de la insulina (Datos ampliados, figura 5c).

La deficiencia sistémica de serina se ha relacionado recientemente con diversos trastornos neurodegenerativos16,25,26,27,28. Por lo tanto, las personas con diabetes que tienen una elevada eliminación de serina podrían ser más susceptibles a comorbilidades neurológicas como la neuropatía periférica asociada a la serina. Para determinar si la deficiencia crónica de serina a largo plazo es suficiente para impulsar la neuropatía periférica, alimentamos a ratones con dietas de control o sin serina y glicina (19,2% de la energía proveniente de la grasa) durante un máximo de 12 meses. La cuantificación temporal de la respuesta térmica al calor reveló una progresión a hipoalgesia después de 12 meses de intervención dietética (Datos ampliados, figura 6a), en consonancia con observaciones previas16. En este momento también detectamos una densidad reducida de fibras nerviosas intraepidérmicas (IENF) en la piel de la pata (Datos ampliados, Fig. 6b), que también es una medida clínica de degeneración de fibras sensoriales pequeñas29. Es de destacar que los ratones alimentados con -SG HFD durante solo tres meses exhibieron una marcada hipoalgesia térmica (Fig. 2j), lo que indica que una combinación de serina sistémica baja y HFD acelera la aparición de neuropatía periférica en ratones.

La serina es esencial para la biosíntesis de los esfingolípidos canónicos, que se enriquecen en el sistema nervioso. Cuando la serina se vuelve limitada, la serina palmitoiltransferasa (SPT) incorpora otros aminoácidos, incluida la alanina, para formar desoxiesfingolípidos no canónicos30,31. Dada la importancia de las ceramidas canónicas y las 1-desoxi(dihidro)ceramidas en la obesidad y la neuropatía, respectivamente15,32, planteamos la hipótesis de que la inhibición de SPT podría influir en los fenotipos observados de obesidad y neuropatía. Por lo tanto, administramos miriocina (0,3 mg kg-1 en días alternos), un inhibidor de SPT o vehículo a ratones alimentados con las dietas anteriores durante 6 meses y cuantificamos la diversidad de esfingolípidos y la detección térmica. De acuerdo con informes anteriores32, el tratamiento con miriocina atenuó el aumento de peso inducido por la HFD sin afectar los niveles plasmáticos de serina y glicina (Datos ampliados, Fig. 6c-f). Sin embargo, la miriocina también mitigó la hipoalgesia térmica exhibida por ratones alimentados con -SG HFD (Fig. 3a), lo que sugiere que una reducción en la actividad de SPT redujo la neuropatía periférica asociada a serina.

a, Latencia térmica en ratones alimentados con LFD más vehículo (veh) (n = 10), LFD más 0,3 mg kg-1 de miriocina (myr) (n = 10), −SG LFD más vehículo (n = 10), −SG LFD más miriocina (n = 9), HFD más vehículo (n = 10), HFD más miriocina (n = 10), −SG HFD más vehículo (n = 10) o −SG HFD más miriocina (n = 9). b, Gráfico de pila de desoxiDHCer hepático en ratones alimentados con LFD más vehículo (n = 10), LFD más miriocina (n = 10), −SG LFD más vehículo (n = 10), −SG LFD más miriocina (n = 9) , HFD más vehículo (n = 10), HFD más miriocina (n = 10), −SG HFD más vehículo (n = 10) o −SG HFD más miriocina (n = 9). c, Evolución del tiempo de latencia térmica en ratones alimentados con LFD más vehículo (n = 12), HFD más vehículo (n = 12), −SG HFD más vehículo (n = 12) o −SG HFD más miriocina (n = 11). d, densidad de IENF en ratones alimentados con LFD más vehículo (n = 10), HFD más vehículo (n = 7), −SG HFD más vehículo (n = 12) o −SG HFD más miriocina (n = 8). e, Distribución de desoxiDHCer en la piel de la pata en ratones alimentados con LFD más vehículo (n = 12), HFD más vehículo (n = 12), −SG HFD más vehículo (n = 12) o −SG HFD más miriocina (n = 11). Los datos son media ± sem y se analizaron mediante ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de diferencia menos significativa de Fisher (a,b,d,e) o ANOVA de dos vías con la prueba post hoc de diferencia menos significativa de Fisher (c). Los análisis estadísticos en b, e se realizaron utilizando la suma de abundancias de desoxiDHCer.

Para comprender mejor los impulsores metabólicos de este fenotipo de neuropatía periférica, a continuación cuantificamos las ceramidas y desoxidihidroceramidas (desoxiDHCer) en el hígado y el nervio ciático. La restricción de serina y glicina aumentó la desoxiDHCer en entornos LFD y HFD y redujo las ceramidas canónicas en el fondo HFD, mientras que la miriocina generalmente redujo la abundancia de esfingolípidos (Fig. 3b y Datos ampliados Fig. 6g-i). Por el contrario, los niveles de ceramida y 1-desoxiesfingolípido no se alteraron o no se correlacionaron con el fenotipo de neuropatía periférica en el nervio ciático, potencialmente debido a los grandes depósitos de lípidos presentes en la mielina (Datos ampliados, Fig. 6h, i). En particular, la restricción de serina en un contexto de LFD no indujo hipoalgesia térmica después de seis meses (Fig. 3a), lo que indica que la acumulación de 1-desoxiesfingolípido por sí sola es insuficiente para impulsar este fenotipo y es consistente con informes recientes de un modelo de ratón Sptlc1C133W33. A continuación, medimos la densidad de IENF, la densidad del nervio corneal y los lípidos tisulares en una cohorte separada de ratones alimentados con LFD, HFD, −SG HFD o −SG HFD más miriocina durante seis meses. La miriocina mitigó la aparición de hipoalgesia térmica en ratones alimentados con -SG HFD (Fig. 3c), y este tratamiento también protegió la densidad nerviosa de fibras pequeñas en la epidermis y la córnea (Fig. 3d y Datos ampliados Fig. 7a, b) sin afectar la detección táctil. o MNCV (Datos ampliados Fig. 7c,d), lo que sugiere que este fenotipo de aparición temprana es específico de las fibras sensoriales pequeñas y los 1-desoxiesfingolípidos, en contraste con otros nodos en el metabolismo de los esfingolípidos34. Los ratones alimentados con −SG HFD mostraron un aumento de 1-desoxiesfingolípidos y esfingomielina hepática, mientras que la miriocina redujo fuertemente los niveles de esfingolípidos, así como los triglicéridos y diacilglicéridos (Datos ampliados, Fig. 7e), destacando aún más los efectos pleiotrópicos de esta molécula en el lipidoma32,35. Finalmente, la piel de la pata mostró un aumento significativo en desoxiDHCer que se redujo con el tratamiento con miriocina (Fig. 3e), lo que sugiere que el microambiente lipídico que rodea las fibras pequeñas puede influir en la función sensorial.

A continuación, evaluamos si la supresión de la actividad de SPT podría mitigar la neuropatía en ratones db / db, que tienen un aumento de desoxiSA circulante, así como un aumento de ceramidas hepáticas y desoxiDHCer (Datos ampliados, Fig. 8a, b). De acuerdo con los resultados en el modelo de neuropatía periférica inducida por la dieta −SG HFD, la administración de miriocina a las seis semanas de edad evitó la progresión a hipoalgesia térmica y restableció la sensación táctil en ratones db/db (Datos ampliados, Fig. 8c, d). La densidad de IENF también aumentó en ratones db/db que recibieron dosis de miriocina durante ocho semanas (Datos ampliados, figura 8e). Aunque la miriocina no afectó el aumento de peso corporal, la hiperglucemia o los niveles de serina en plasma (Datos ampliados, figuras 8f-h), redujo fuertemente los esfingolípidos canónicos en el hígado, pero mostró efectos limitados en los 1-desoxiesfingolípidos y ceramidas de la piel de las patas (Datos ampliados, figura 8i). -norte). Por tanto, la miriocina probablemente actúa a través de mecanismos directos e indirectos dirigidos al hígado y otros tejidos, lo que también explica su toxicidad35.

Teniendo en cuenta la deficiencia crónica de serina que presentan los ratones diabéticos, a continuación alimentamos a los ratones db/db con una dieta enriquecida con serina al 3% a partir de las 6 semanas de edad y cuantificamos los fenotipos de neuropatía. La sensación térmica se midió a las 6, 10 y 14 semanas de edad y la sensación táctil en el momento del sacrificio, momento en el que los ratones exhibieron niveles elevados de serina plasmática y hepática, pero no de glicina (Fig. 4a, b). No observamos cambios en el peso corporal y un ligero aumento en los niveles de glucosa circulante en esta cohorte (Datos ampliados, Fig. 9a, b). Sin embargo, tanto la hipoalgesia térmica como la táctil se redujeron en ratones alimentados con esta dieta enriquecida en serina (Fig. 4c, d). Es de destacar que no se observaron cambios en los esfingolípidos canónicos en todos los tejidos, sin embargo, los 1-desoxiesfingolípidos disminuyeron considerablemente tanto en el hígado como en la piel de las patas (Fig. 4e, f y Datos ampliados, Fig. 9c-f). En conjunto, estos datos sugieren que la suplementación con serina puede retardar la progresión de la neuropatía periférica diabética.

a, Niveles de aminoácidos en plasma en estado de alimentación en ratones BKS-db/db alimentados con una dieta de control (n = 8) o suplementada con serina (n = 9) durante 8 semanas. b, Contenido de aminoácidos del hígado en estado alimentado en ratones BKS-db/db alimentados con una dieta de control o suplementada con serina durante 8 semanas (n = 8 por grupo). c, Evolución del tiempo de latencia térmica en ratones BKS-db/db alimentados con una dieta de control (n = 8) o suplementada con serina (n = 9). d, Detección táctil 8 semanas después de alimentar a ratones BKS-db/db con una dieta de control (n = 8) o suplementada con serina (n = 9). e, Niveles de desoxiDHCer en el hígado en ratones BKS-db/db alimentados con una dieta de control o suplementada con serina durante 8 semanas (n = 8 por grupo). f, Niveles de desoxiDHCer en la piel de la pata de ratones BKS-db/db alimentados con una dieta de control o suplementada con serina durante 8 semanas (n = 8 por grupo). Los datos son media ± sem y se analizaron mediante una prueba t independiente bilateral (a, b, d – f) o ANOVA bidireccional con la prueba post hoc de diferencia menos significativa de Fisher (c). Los análisis estadísticos en e,f se realizaron utilizando la suma de abundancias de desoxiDHCer.

Aquí describimos cómo la inducción directa o indirecta de la deficiencia sistémica crónica de serina altera la homeostasis de los lípidos y contribuye a la neuropatía periférica diabética. La modulación de la dislipidemia con miriocina o la biosíntesis de 1-desoxiesfingolípido con suplementos de serina mitiga la hipoalgesia térmica y táctil en ratones diabéticos obesos. Estos resultados resaltan cómo la deficiencia de serina puede crear sinergia con la dislipidemia para alterar los fenotipos neurológicos tanto en contextos de enfermedades raras16,25,26 como indirectamente a través de una enfermedad crónica generalizada como la diabetes tipo 2, donde se manifiesta como una comorbilidad experimentada por un subconjunto de pacientes. La reducción de la serina y la glicina circulantes en ratones diabéticos puede deberse a un aumento del flujo a través de la gluconeogénesis, el metabolismo de un carbono, la retención renal18,36 y/o la eliminación como acilglicinas37, que también están influenciados por la dislipidemia38.

Una STT, análoga a una prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT), podría identificar pacientes que presentan una eliminación posprandial elevada de serina y que podrían ser particularmente susceptibles a la neuropatía sensorial. La normalización de los niveles de serina circulante mediante suplementos dietéticos retrasa la aparición y progresión de la neuropatía sensorial en ratones db/db. De hecho, la suplementación con serina y vitaminas B mejora la neuropatía periférica en algunos modelos preclínicos y son el foco de ensayos clínicos para diversos trastornos neurodegenerativos39,40,41 (ClinicalTrials.gov: NCT03062449). Nuestros resultados resaltan vínculos moleculares fisiológicamente relevantes entre la homeostasis de la serina y la glicina, el metabolismo de los esfingolípidos y las comorbilidades diabéticas. Los fenotipos metabólicos y neuropáticos de los modelos de diabetes y obesidad en ratones varían según las cepas y los genotipos42,43, y los ratones C57BL6/J son particularmente sensibles a las consecuencias metabólicas de la HFD debido a mutaciones en Nnt44 y otros genes. Sin embargo, nuestros datos tanto en ratones diabéticos db/db como en ratones C57BL/6J alimentados con −SG HFD demuestran que la deficiencia de serina combinada con dislipidemia puede impulsar la neuropatía periférica en diferentes orígenes genéticos.

Quedan varias preguntas clave, incluido por qué la privación de serina y glicina suprime la síntesis de ácidos grasos hepáticos y la expresión genética en el hígado. Además, diversas especies de esfingolípidos y/o su mala localización contribuyen a la neuropatía21,45,46,47,48, pero sus mecanismos exactos de toxicidad aún no están claros. Hemos desarrollado y validado un modelo dietético de neuropatía sensorial asociada a serina que desarrolla un fenotipo en tres meses, lo que podría ayudar a comprender cómo se puede tratar la dislipidemia neurotóxica. Diversos cambios genéticos pueden influir en la serina y la glicina circulantes, incluidos polimorfismos comunes de un solo nucleótido y eventos de codificación raros25,28,49, o tales deficiencias podrían ser inducidas por el metabolismo hepático reconfigurado inducido por la diabetes. Por lo tanto, al alterar la diversidad de esfingolípidos y comprometer la capacidad del hígado para manejar la sobrecarga nutricional de lípidos, la deficiencia sistémica de serina emerge como un modificador de las neuropatías asociadas a la edad y la diabetes.

Todos los experimentos con ratones fueron aprobados y realizados de acuerdo con el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales (IACUC) de la Universidad de California, San Diego y el Instituto Salk de Estudios Biológicos. Los ratones se alojaron en la misma habitación asegurando la exposición a la misma temperatura (21 °C), humedad (humedad ambiente 65%) y un ciclo de luz:oscuridad de 12 h (06:00 a 18:00). En la Fig. 1, ratones C57BL/6J (JAX 000664) o BKS-db/db (JAX 000642) de 14 a 16 semanas de edad, y C57BL/6J de 10 a 12 semanas tratados con vehículo o STZ (JAX 000664) los ratones se mantuvieron en ayunas durante 6 h antes de la recolección de tejido. Los animales se anestesiaron con isoflurano, se decapitaron y los tejidos se recogieron rápidamente utilizando pinzas Wollenberger preenfriadas a la temperatura del nitrógeno líquido y almacenados a -80 °C hasta el análisis. Para la Fig. 2, se alimentó a C57BL/6J (JAX 000664) de 8 semanas de edad con dietas obtenidas de Envigo. La composición de la dieta se detalla en la Tabla complementaria 1. En los experimentos dietéticos, los tejidos se recolectaron entre las 07:00 y las 10:00 h, es decir, en estado de alimentación, a menos que se indique lo contrario. De una cohorte separada de animales, se recolectaron muestras de plasma 18 semanas después de la intervención dietética en estado de alimentación (07:00 a 10:00 h) y en ayunas (ayuno nocturno de 18 h). En experimentos con ratones db/db, los tejidos se recogieron después de un ayuno de 6 h. Para la Fig. 3, se alimentó a C57BL/6J (JAX 000664) de 8 semanas de edad con dietas obtenidas de Envigo. La recolección de tejidos se realizó entre las 07:00 y las 10:00 h. Los animales se anestesiaron con isoflurano, se decapitaron y los tejidos se recogieron rápidamente utilizando pinzas Wollenberger preenfriadas a la temperatura del nitrógeno líquido y almacenados a -80 °C hasta el análisis. Para la Fig. 4, se alimentaron ratones BKS-db/db de 6 semanas de edad (JAX 000642) con una dieta de control o suplementada con serina (proporcionada por Envigo) durante un período de 8 semanas. La recolección de tejidos se realizó entre las 07:00 y las 10:00 h, a menos que se indique lo contrario. Los animales se anestesiaron con isoflurano, se decapitaron y los tejidos se recogieron rápidamente utilizando pinzas Wollenberger, preenfriados a la temperatura del nitrógeno líquido y almacenados a -80 °C hasta el análisis.

Se mantuvieron en ayunas durante la noche ratones C57BL/6J (JAX 000664) de 14 a 16 semanas de edad de la misma edad y BKS-db/db, y ratones C57BL/6J (JAX 000664) tratados con vehículo y STZ de 10 a 12 semanas de edad con acceso a agua. proporcionado ad libitum. Para un STT, se pesaron los animales y se les administró serina y/o glucosa mediante sonda oral a una dosis de 400 mg kg-1 y 2 g kg-1, respectivamente, y se recogieron muestras de sangre de la punta de la cola en tubos microvette recubiertos con EDTA ( Sarstedt) antes y 15, 30, 60, 120 y 180 min después de una sonda oral. Se centrifugaron microvetitas con EDTA a 2000 ga 4 °C durante 5 minutos para obtener plasma y las muestras se almacenaron a -80 °C hasta el análisis. Las concentraciones de glucosa y serina en sangre se cuantificaron utilizando el glucómetro Contour Next (Bayer) y la cromatografía de gases-espectrometría de masas como se describe a continuación, respectivamente. La farmacocinética de la serina plasmática se determinó para una dosis de 400 mg kg-1 utilizando PK solver50.

Para calificar el destino posterior de la serina, los ratones de tipo salvaje se mantuvieron en ayunas durante la noche, se pesaron por la mañana y se les administró serina [U-13C3] mediante sonda oral a una dosis de 400 mg kg-1, con tejidos recolectados, utilizando pinzas Wollenberger previamente. se enfrió a la temperatura del nitrógeno líquido, antes y 15, 30, 45, 60 y 120 minutos después de la sonda oral, y las muestras se almacenaron a -80 ° C hasta el análisis.

Se utilizaron kits disponibles comercialmente para determinar la insulina sérica (Mouse Insulin ELISA 10-1247-01, Mercodia) y el glucagón (Glucagon ELISA 10-1271-01, Mercodia) después de un ayuno de 6 h en ratones de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

A ratones C57BL/6J alimentados con dietas durante 18 semanas se les inyectó por vía intraperitoneal D2O (en NaCl al 0,9%) a una dosis de 0,027 ml por g de peso corporal con agua potable reemplazada por una solución enriquecida con D2O al 6% durante un período de ~18 h. Por la mañana (07:00 a 10:00 h), los tejidos se recogieron rápidamente utilizando pinzas Wollenberger preenfriadas a la temperatura del nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta el análisis.

El enriquecimiento de D2O en plasma se determinó mediante el protocolo de intercambio deuterio-acetona como se describió anteriormente24. En resumen, se incubaron 5 µl de plasma con 4 µl de acetona al 5% en solución de acetonitrilo y 4 µl de NaOH 10 M durante 24 h. A continuación, se añadieron 500 mg de Na2SO4 y 600 µl de cloroformo y las muestras se mezclaron con vórtex. Después de una centrifugación de 2 minutos a 3000 g, se transfirieron 80 µl por triplicado a viales de cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) y se cuantificó el enriquecimiento de D2O en plasma a partir de una curva estándar externa en una columna Agilent DB-35MS (30 m por 0,25 mm de diámetro interno × 0,25 μm, Agilent J&W Scientific) instalado en un cromatógrafo de gases (GC) Agilent 7890 A interconectado con un espectrómetro de masas Agilent 5975 C con el siguiente programa de temperatura: 60 °C inicial, aumentar en 20 °C min-1 a 100 °C, aumentar 50 °C min-1 a 220 °C y mantener durante 1 min.

Para cuantificar el etiquetado de D2O en el tejido, se homogeneizaron ~ 20 mg de tejido congelado con 250 µl de metanol a -20 °C, 250 µl de solución salina helada y 500 µl de cloroformo a -20 °C enriquecidos con estándares internos palmitato-d31 (Cambridge Isotope Laboratories, DLM -215-PK) y coprostanol (Sigma, 7578). Después de un centrifugado de 5 minutos a 4 °C a 21.000 g, la fracción de cloroformo se recogió, se secó y se resuspendió con 500 µl de H2SO4 al 2 % en metanol durante 2 h a 50 °C. A continuación, se agregaron 100 µl de NaCl saturado y 500 µl de hexano, las muestras se mezclaron con vórtice y la fase superior de hexano se recogió y se transfirió a un vial de GC-MS. Los ésteres metílicos de ácidos grasos se analizaron utilizando una columna Select FAME (100 m × 0,25 mm de diámetro interno) instalada en un GC Agilent 7890 A interconectado con un MS Agilent 5975 C usando el siguiente programa de temperatura: 80 °C inicial, aumento de 20 °C min-1 a 170 °C, aumentar en 1 °C min-1 a 204 °C, luego 20 °C min-1 a 250 °C y mantener durante 10 min. La distribución porcentual de isotopólogos de cada ácido graso y metabolito polar se determinó y se corrigió según la abundancia natural mediante algoritmos internos adaptados de un informe anterior51.

Para GTT e ITT, los ratones C57BL/6J alimentados con las dietas durante 18 semanas estuvieron en ayunas durante la noche con agua proporcionada ad libitum. Por la mañana se pesaron los animales y se determinó la glucosa en sangre en ayunas a partir de un sangrado de la cola utilizando un glucómetro Contour Next (Bayer). Para GTT, a los animales se les inyectó por vía intraperitoneal un bolo de glucosa a una dosis de 2 g kg-1 de peso corporal, y se determinó la glucosa en sangre a los 15, 30, 60, 120 y 180 minutos después de la inyección. Para ITT, a los animales se les inyectó por vía intraperitoneal un bolo de insulina (100 UI ml-1 Humulin Insulin, Eli Lilly) a una dosis de 0,5 UI kg-1, y se cuantificó la glucosa en sangre a los 15, 30, 60 y 90 minutos después. -inyección como se describió anteriormente52.

Las masas magras y grasas se determinaron utilizando un instrumento EchoMRI 3 en 1 (sistema de imágenes por resonancia magnética nuclear cuantitativa (qNMR)). Se utilizó el Sistema Integral de Monitoreo de Animales de Laboratorio (CLAMS) (Oxymax, Columbus Instruments) para cuantificar las tasas metabólicas sistémicas en ratones alojados individualmente durante un período de 6 días. La ingesta de agua, alimentos y calorías se calculó a partir de animales alojados individualmente durante un período de 6 días cuando se los sometió a CLAMS. Las tasas de consumo de oxígeno (VO2) y dióxido de carbono (VCO2) de todo el cuerpo se normalizaron con respecto al peso corporal total correspondiente, y el RER se calculó como la relación entre VCO2 y VO2.

Se desecó aproximadamente 1 g de heces durante la noche y se molieron usando un mortero. La muestra en polvo se reconstituyó en un sedimento con 300 µl de ddH2O y se pesó. El pellet se colocó en un cilindro de bomba rodeado por 2000 ml de ddH2O (calorímetro de chaqueta compensada Parr 6100). El calor producido por la combustión se midió mediante el cambio en la temperatura del agua. El equivalente de energía calorimétrica, W (Cal °C-1), se calculó con ácido benzoico estandarizado. El contenido energético final de cada pellet se calculó de la siguiente manera:

La absorción de calorías se calculó restando la energía bruta (extracción de calorías fecales) de la ingesta de calorías.

El ADN se extrajo de 10 a 30 mg de heces utilizando el kit de aislamiento de ADN MoBio PowerFecal (12830-50). El ADN extraído se cuantificó utilizando un Nanodrop (ThermoFisher Scientific). Los datos sin procesar de la secuenciación del genoma completo se cargaron en Qiita53, donde seguimos su flujo de trabajo de procesamiento predeterminado. En resumen, las lecturas sin procesar se filtraron mediante el adaptador utilizando los parámetros de detección automática en fastp versión 2054 y el host (mouse) se filtró usando minimap2 versión 2.1755. Las secuencias resultantes se alinearon usando Bowtie 2 versión 2.4.256 con la base de datos de referencia Web of Life (WoL)57 a través de la aplicación Web of Life Toolkit (https://github.com/qiyunzhu/woltka); Este paso generó tablas por género, especie, por genoma y por gen. Para todos los análisis utilizamos la tabla por genoma; luego, para la diversidad alfa, eliminamos cualquier muestra por debajo de 1.273.062 secuencias por muestra y para el análisis de diversidad beta, enrarecimos al mismo valor. Los análisis posteriores se realizaron en QIIME 2 versión 2020.1158. Para evaluar las alteraciones globales de la microbiota, se realizó un análisis de diversidad alfa mediante PD59 de Faith y diversidad beta mediante un análisis robusto de componentes principales (RPCA)60 y las distancias de Aitchison resultantes se evaluaron mediante un análisis de varianza multivariado permutacional (PERMANOVA)61.

Luego diseñamos un modelo jerárquico bayesiano para la abundancia diferencial incorporando el tipo de dieta como efecto fijo y la jaula como efecto aleatorio. Modelamos el proceso de generación de conteo como una distribución binomial negativa para tener en cuenta la sobredispersión. Debido a la escasez de datos sobre el microbioma, también tomamos en cuenta la inflación cero asignando a cada microbio una probabilidad de no ser observado por separado del proceso de generación del conteo:

Escribimos este modelo usando el lenguaje de programación probabilística Stan62 y ajustamos el modelo usando BIRDMAn (https://github.com/gibsramen/BIRDMAn). Para tener en cuenta la composicionalidad, ajustamos este modelo utilizando el primer microbio de la tabla como referencia de relación logarítmica aditiva y convertimos los cambios de pliegue logarítmico en coordenadas de relación logarítmica centradas después del ajuste. Utilizamos lo siguiente como distribuciones previas para los parámetros objetivo:

en el que i es la muestra, j es la característica, y es el recuento microbiano, θ es el indicador de cero no biológico, η es el recuento medio de características, x es la covariable, β son los coeficientes de regresión que se estimarán (log -cambios de veces), π es la probabilidad de cero no biológico, z es la variable identificadora de la jaula, u es el efecto aleatorio de la jaula y ϕ es el parámetro de sobredispersión. Para comparar los cambios funcionales asociados con las abundancias diferenciales del nivel de cepa, se adoptó un enfoque de integridad de la vía genómica comparativa. En primer lugar, cada genoma se evaluó a través de la integridad de la vía MetaCyc63, una proporción que varía de cero a uno, mediante el mapeo de genes caracterizados en reacciones y, finalmente, en vías. Luego, cada vía se correlacionó mediante la correlación de rangos de Spearman con la abundancia diferencial beta determinada a partir del modelo anterior. Las vías de biosíntesis de serina, escisión de glicina y síntesis de ácidos grasos se correlacionaron significativamente con las betas. Para validar estas correlaciones, se evaluó entre los grupos de tratamiento la relación logarítmica de la suma de la abundancia de genomas con vías completas (integridad = 1) frente a aquellos sin (integridad <1).

La función de la fibra sensorial C pequeña se cuantificó mediante respuestas conductuales al calor utilizando un dispositivo de prueba de nocicepción térmica (UARD) como se describió anteriormente64. En resumen, la superficie del aparato se calentó hasta 30 °C y los animales se colocaron en cámaras de prueba individuales durante 20 a 30 minutos antes de la prueba. Se realizaron cuatro mediciones de latencia de respuesta separadas y se tomó la media del último triplicado para representar la latencia de respuesta para cada animal. Todas las mediciones fueron realizadas en animales codificados por un observador que desconocía los grupos de tratamiento.

Los animales se colocaron en el soporte de von Frey y se les permitió aclimatarse durante 20 a 30 minutos. Se utilizó la gama de filamentos manuales von Frey: 2,44, 2,83, 3,22, 3,61, 3,84, 4,08, 4,31, 4,56, 4,74 (Kom Kare). Las pruebas comenzaron con el filamento 3,84 y la presión aplicada se repitió cinco veces. Si se observaba una respuesta positiva, se utilizaba el siguiente filamento de menor peso en la secuencia. En el caso de una respuesta negativa, se aplicó el siguiente filamento de mayor peso. Todas las mediciones fueron realizadas en animales codificados por un observador que desconocía los grupos de tratamiento.

La conducción de un nervio motor se cuantificó en ratones anestesiados utilizando el sistema EZ Anesthesia Versaflex (Braintree Scientific, Z-7150). En resumen, se transfirieron ratones ligeramente anestesiados a una almohadilla calentada con agua y se mantuvo la anestesia mediante una mascarilla. Se insertaron dos electrodos de platino entre el segundo, tercer y cuarto dedo del animal y un electrodo de conexión a tierra en la piel del cuello. El estimulador PowerLab entregó un estímulo de onda cuadrada de 200 mV y 50 µs cada 2 s. El electrodo de estimulación se insertó en el tobillo cerca del tendón de Aquiles y posteriormente en la hendidura ciática de la cadera, y se registraron ondas M. La latencia entre el tendón de Aquiles y la escotadura ciática se utilizó para calcular la velocidad de conducción nerviosa como se describe64. Todas las mediciones fueron realizadas en animales codificados por un observador que desconocía los grupos de tratamiento.

La cuantificación de los nervios corneales se realizó en ratones anestesiados (usando el sistema EZ Anesthesia Versaflex, Braintree Scientific, Z-7150) usando Retina Tomograph 3 con Rostock Cornea Module (Heidelberg Engineering) equipado con Tomocap (Heidelberg Engineering, 0220-001) como se describió anteriormente64. En resumen, se transfirieron ratones ligeramente anestesiados a una plataforma para animales pequeños con anestesia mantenida mediante una mascarilla. Se recogieron cuarenta imágenes secuenciales de aumento y tamaño uniformes y se identificaron aquellas que contenían nervios del plexo subbasal. Se utilizó el software ImageJ (ImageJ 1.53e Java 1.8.0_172) para cuantificar el área del nervio corneal dentro de cada imagen, con los datos presentados como píxeles/imagen. Todas las mediciones fueron realizadas en animales e imágenes codificadas por un observador que desconocía los grupos de tratamiento.

La cuantificación de la inervación epidérmica se realizó en muestras de piel de las patas mediante inmunotinción para la proteína panneuronal PGP9.5, como se describió anteriormente en detalle64. En resumen, se recogieron muestras de piel de las patas en paraformaldehído tamponado al 4% (Thermo Scientific, J19943-K2). La tinción de los nervios epidérmicos se realizó utilizando el anticuerpo anti-PGP9.5 (ProteinTech, 14730-1-AP; dilución 1:500). Usando un aumento de 40X de un microscopio óptico, se calculó el número de perfiles positivos para PGP9.5 presentes en la epidermis, se calculó la longitud de la sección de piel y se expresó la densidad del perfil IENF como perfiles mm-1. Todas las mediciones fueron realizadas en portaobjetos codificados por un observador que desconocía los grupos de tratamiento.

Los metabolitos polares del plasma se extrajeron de 3 µl de plasma enriquecido con una cantidad conocida de estándares marcados con 13C y 15N (Cambridge Isotope Laboratories, MSK-A2-1.2). La extracción de metabolitos tisulares se realizó como se describió anteriormente21. En resumen, se homogeneizaron ~20 mg de tejido durante 2 minutos usando perlas Precellys con 500 µl de metanol a -20 °C, 400 µl de solución salina helada y 100 µl de agua helada y se les agregaron estándares de metabolitos polares 13C/15N (isótopo de Cambridge). Laboratories, MSK-A2-1.2), 20 pmol de esfinganina-d7 (Avanti Polar Lipids, 860658), 2 pmol de desoxiesfinganina-d3 (Avanti Polar Lipids, 860474), 100 pmol de 13C-dihidroceramida-d7 (Avanti Polar Lipids, 330726), 200 pmol de C15-ceramida-d7 (Avanti Polar Lipids, 860681), 10 pmol de glucosilesfingosina d18:1-d7 (Avanti Polar Lipids, 860695), 100 pmol de glucosilceramida d18:1-d7/15:0 ( Avanti Polar Lipids, 330729), 100 pmol de lactosilceramida d18:1-d7/15:0 (Avanti Polar Lipids, 330727), 200 pmol de esfingosina-d7 (Avanti Polar Lipids, 860657) y 200 pmol de d18:1/ Esfingomielina 18:1-d9 (Avanti Polar Lipids, 791649). La identificación de 1-desoxidihidroceramidas se confirmó mediante la coincidencia del tiempo de retención y el análisis de los estándares m18:0/24:1 deoxyDHCer (Avanti Polar Lipids, 860464) y m18:0/16:0 deoxyDHCer (Avanti Polar Lipids, 860462), y normalización. para 1-desoxidihidroceramidas se realizó con el estándar 13C-dihidroceramida-d7. Se tomó una alícuota de homogeneizado de 50 µl para determinar el contenido de proteína del tejido utilizando el ensayo de proteína BCA (Lambda Biotech, G1002). El homogeneizado restante se transfirió a un tubo Eppendorf de 2 ml y se añadió 1 ml de cloroformo a -20 °C. Las muestras se mezclaron con vórtex durante 5 minutos y se centrifugaron durante 5 minutos a 4 °C a 15.000 g. Se recogió la fase orgánica y se añadieron 2 µl de ácido fórmico a la fase polar restante que se volvió a extraer con 1 ml de cloroformo a -20 °C. Se secaron las fases orgánicas combinadas y el sedimento se resuspendió en 100 µl de tampón que contenía metanol al 100 %, formiato de amonio 1 mM y ácido fórmico al 0,2 %. Los datos representan recuentos de iones normalizados por estándares internos específicos de clase y contenido de proteína tisular, con gráficos apilados para representar la distribución de la cadena de acilo.

La cuantificación de los metabolitos polares se determinó después de la derivatización con clorhidrato de metoxiamina al 2% (p/v) (Thermo Scientific) en piridina (37 °C durante 60 min) y con N-tercbutildimetilsilil-N-metiltrifluoroacetamida (MTBSTFA) con terc-butildimetilclorosilano al 1%. (tBDMS) (Regis Technologies) (37 °C durante 30 min). Los derivados polares se analizaron mediante GC-MS utilizando una columna DB-35MS (30 m × 0,25 mm de diámetro interno × 0,25 μm, Agilent J&W Scientific) instalada en un cromatógrafo de gases Agilent 7890 A interconectado con un espectrómetro de masas Agilent 5975 C como se describió anteriormente65. El enriquecimiento de glucosa en plasma se determinó mediante derivatización con anhídrido propiónico como se describió anteriormente66. La abundancia de isótopos naturales se corrigió utilizando un guión interno51.

La cuantificación de los metabolitos de los esfingolípidos se determinó mediante una plataforma de cromatografía líquida de triple cuadrupolo y espectrometría de masas (Agilent 6460). Las especies de esfingolípidos se separaron en una columna C8 (Spectra 3 μm C8SR 150 × 3 mm de diámetro interior, Peeke Scientific) como se describió anteriormente67. La fase móvil A estaba compuesta por 100 % de agua de calidad HPLC que contenía formiato de amonio 2 mM y 0,2 % de ácido fórmico y la fase móvil B consistía en 100 % de metanol que contenía 0,2 % de ácido fórmico y 1 mM de formiato de amonio. El caudal fue de 0,5 ml min-1. El programa de elución en gradiente consistió en el siguiente perfil: 0 min, 82% B; 3 min, 82% B; 4 min, 90 % B, 18 min, 99 % B; 25 min, 99 %, 27 min, 82 % B, 30 min, 82 % B. El reequilibrio de la columna siguió a cada muestra y duró 10 min. El voltaje capilar se ajustó a 3,5 kV, la temperatura del gas de secado fue 350 °C, el caudal del gas de secado fue 10 l min-1 y la presión del nebulizador fue 60 psi. Las especies de esfingolípidos se analizaron mediante monitoreo de reacción selectiva (SRM) de la transición de iones precursores a iones producto en energías de colisión optimizadas asociadas y voltajes fragmentadores (Tabla complementaria 2). La cuantificación de las especies de esfingolípidos se realizó utilizando estándares deuterados añadidos.

Se extrajeron alrededor de 10 a 20 mg de tejido congelado con 800 µl de -20 °C 5:3:2 acetonitrilo: metanol: solución de agua con una concentración conocida de norvalina como estándar interno utilizando el homogeneizador Precellys Evolution (Bertin Technologies)68 . Después de la extracción, se tomó una alícuota de 50 µl para la cuantificación de proteínas mediante el ensayo de proteínas BCA (Lambda Biotech, G1002) y el extracto restante se centrifugó durante 10 minutos a 21 000 g a 4 °C. Luego se transfirió el sobrenadante a un vial de vidrio y se realizó la separación cromatográfica y la identificación del compuesto usando Q Exactive Orbitrap MS con un sistema Vanquish Flex Binary UHPLC (ThermoFisher Scientific) en un iHILIC-(P) Classic, 150 mm por 2,1 mm, 5- Partículas de mm, columna de 200 Å (Hilicon) a 45 °C. La cromatografía se realizó utilizando un gradiente de carbonato de amonio 20 mM, ajustado a pH 9,4 con solución de hidróxido de amonio al 0,1% (25%) (fase móvil A) y acetonitrilo al 100% (fase móvil B), ambos a un caudal de 0,2 ml min. −1. El gradiente de cromatografía líquida transcurrió linealmente de 80 a 20 % de B de 2 a 17 min y luego de 20 a 80 % de B de 17 a 18 min y luego se mantuvo a 80 % de B de 18 a 25 min.

Las muestras de hígado se extrajeron en 400 µl de metanol a -20 °C utilizando el homogeneizador Precellys Evolution (Bertin Technologies) enriquecido con estándar etiquetado EquiSPLASH (Avanti Polar Lipids, 330731) y norvalina. Después de la extracción, se tomó una alícuota de 50 µl para cuantificar el contenido de proteína utilizando el ensayo de proteína BCA (Lambda Biotech, G1002) y al extracto restante se le agregaron 400 µl de cloroformo a -20 °C y 400 µl de agua helada. Después de agitar durante 5 minutos, las muestras se centrifugaron durante 5 minutos a 4 °C a 15.000 gy se recogió la fase orgánica. Se agregaron dos microlitros de ácido fórmico a la fase polar restante que se volvió a extraer con 400 µl de cloroformo a -20 °C, las muestras se mezclaron con vórtex y se centrifugaron como se describe anteriormente. Se secaron las fases orgánicas combinadas y el sedimento se resuspendió en 100 µl de isopropanol.

La separación cromatográfica y la identificación de especies de lípidos se realizaron utilizando el espectrómetro de masas Q Exactive orbitrap con un sistema Vanquish Flex Binary UHPLC (Thermo Scientific) equipado con una columna Accucore C30, 150 × 2,1 mm, 2,6 µm de partículas (Thermo) a 40 °C. Se inyectaron cinco microlitros de muestra. La cromatografía se realizó utilizando un gradiente de 40:60 v/v de agua: acetonitrilo con formiato de amonio 10 mM y ácido fórmico al 0,1 % (fase móvil A) y 10:90 v/v de acetonitrilo: propan-2-ol con formiato de amonio 10 mM. y ácido fórmico al 0,1% (fase móvil B), ambos a un caudal de 0,2 ml min-1. El gradiente de cromatografía líquida fue del 30 % al 43 % de B de 3 a 8 min, luego del 43 % al 50 % de B de 8 a 9 min, luego del 50 al 90 % de B de 9 a 18 min, luego del 90 al 99 % de B. de 18 a 26 min, luego se mantuvo al 99% B de 26 a 30 min, antes de volver al 30% B en 6 min y se mantuvo durante 4 min más.

Los lípidos se analizaron en modo positivo utilizando un voltaje de pulverización de 3,2 kV. El flujo de gas de barrido fue de 1 unidad arbitraria, el flujo de gas auxiliar de 2 unidades arbitrarias y el flujo de gas envolvente de 40 unidades arbitrarias, con una temperatura capilar de 325 °C. Se utilizó espectrometría de masas completa (rango de exploración 200–2000 m/z) con una resolución de 70.000 con control automático de ganancia 106 y un tiempo de inyección máximo de 100 ms. Se utilizó el modo MS2 (Top 6) dependiente de los datos con una resolución de 17.500 con control automático de ganancia establecido en 105 con un tiempo de inyección máximo de 50 ms. Los datos se analizaron utilizando el software EI-Maven y los picos se normalizaron según el estándar interno Avanti EquiSPLASH. Los fragmentos específicos de especies de lípidos utilizados para la identificación y cuantificación se presentan en la Tabla complementaria 3.

Los esfingolípidos plasmáticos se procesaron como se describió anteriormente con modificaciones menores69. En resumen, se mezclaron 50 µl de plasma con 0,5 ml de metanol y se les agregaron estándares internos, esfinganina-d7, esfingosina-d7 y desoxiesfinganina-d3 (lípidos Avanti). Las muestras se colocaron en un mezclador durante 1 h a 37 °C, se centrifugaron a 2800 gy el sobrenadante se recogió y se hidrolizó con ácido durante la noche a 65 °C con 75 µl de HCl metanólico (HCl 1 N, H2O 10 M en metanol). A continuación, se añadieron 100 µl de KOH 10 M para neutralizar. Se añadieron 625 µl de cloroformo, 100 µl de NH4OH 2 N y 500 µl de agua alcalina, las muestras se mezclaron con vórtex y se centrifugaron durante 5 minutos a 16.000 g. La fase orgánica inferior se lavó tres veces con agua alcalina y se secó al aire. El análisis LC-MS se realizó en un LC-MS/MS Agilent 6460 QQQ. La separación de metabolitos se logró con una columna C18 (Luna 100 × 2,1 mm, 3 µm, Phenomenex). La fase móvil A estaba compuesta por una proporción de 60:40 de metanol:agua y la fase móvil B consistía en 100 % de metanol con 0,1 % de ácido fórmico con formiato de amonio 5 mM agregado a ambas fases móviles. El programa de elución en gradiente consistió en mantener un 40 % de B durante 0,5 min, aumentar linealmente hasta un 100 % de B durante 15 min y mantenerlo durante 9 min, seguido de un reequilibrio a la condición inicial durante 10 min. El voltaje capilar se ajustó a 3,5 kV, la temperatura del gas de secado fue 350 °C, el caudal del gas de secado fue 10 l min-1 y la presión del nebulizador fue 60 psi. Las bases esfingoideas se analizaron mediante SRM de la transición de iones precursores a iones producto con energías de colisión optimizadas y voltajes fragmentadores asociados16. Luego se cuantificaron las bases esfingoideas a partir de estándares internos enriquecidos de concentración conocida.

Se extrajeron muestras congeladas de hígado y riñón en un tampón helado que contenía KH2PO4 50 mM, Na2EDTA 1 mM y DTT 1 mM, pH 8,0, utilizando un homogeneizador de vidrio. La actividad enzimática máxima se determinó mediante una reacción enzimática acoplada con lactato deshidrogenasa (Sigma 10127230001) en presencia de serina 200 mM, NADH 0,25 mM, fosfato de piridoxal 0,17 mM y DTT 1 mM durante 3 minutos. Posteriormente, se determinó la cuantificación de la proteína del homogeneizado de tejido utilizando el ensayo de proteína BCA (Lambda Biotech, G1002) y la actividad enzimática máxima se expresó en unidades internacionales (U) por mg de proteína.

El ARN se extrajo de ~ 20 mg de tejido hepático utilizando el kit Direct-Zol RNA (kit Direct-Zol RNA Miniprep Plus, Zymo Research) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La síntesis de ADNc se realizó utilizando iScript Reverse Transcription Supermix para RT-PCR (iScript Reverse Transcription Supermix, Bio-Rad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando el siguiente protocolo: 5 min a 25 °C, 20 min a 46 °C, 1 min a 95 °C. C. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando placas de 96 pocillos en un sistema de PCR en tiempo real ViiA 7 de Applied Biosystems utilizando los siguientes parámetros: 95 °C durante 20 s, 40 ciclos de 95 °C durante 1 s y 60 °C durante 20 s. . El volumen final (10 µl) de la reacción de PCR SYBR-Green consistió en 5 µl de mezcla maestra rápida de SYBR-Green (Applied Biosystems), 2 µl de ADNc, 1 µl de cebadores directos e inversos 5 µM y 1 µl de agua.

Los cebadores utilizados son los siguientes. 18s adelante: AGTCCCTGCCCTTTGTACCACA, 18s atrás: CGATCCGAGGGCCTCACTA; Acc1 hacia adelante: AATGAACGTGCAATCCGATTTG, Acc1 hacia atrás: ACTCCACATTTGCGTAATTGTTG; Acc2 hacia adelante: CGCTCACCCAACAGTAAGGTGG, Acc2 hacia atrás: GCTTGGCAGGGAGTTCCTC; Acly hacia adelante: AATCCTGGCTAAAACCTCGCC, Acly hacia atrás: GCATAGATGCACACGTAGAACT; actina directa: GGCTGTATTCCCTCCATCG, actina inversa: CCAGTTGGTAACAATGCCATGT; Aldh1l1 adelante: AGCCACCTATGAGGGGCATTC, Aldh1l1 reverso: TGAGTGTCGAGTTGAAAAACGTC; Aldh1l2 adelante: ACCAGCCGGGTTTATTTCAAA, Aldh1l2 reverso: ACTCCCACTACTCGTGGC; Dgat1 hacia adelante: CTGATCCTGAGTAATGCAAGGTT, Dgat1 hacia atrás: TGGATGCAATAATCACGCATGG; Dgat2 hacia adelante: GCGCTACTTCCGAGACTACTT, Dgat2 hacia atrás: GGGCCTTATGCCAGGAAACT; Dhcr7 adelante: AGGCTGGATCTCAAGGACAAT, Dhcr7 atrás: GCCAGACTAGCATGGCCTG; Dhcr24 adelante: CTCTGGGTGCGAGTGAAGG, Dhcr24 reverso: TTCCCGGACCTGTTTCTGGAT; Dld hacia adelante: AGCTGGAGTCGTGTGTACC, Dld hacia atrás: GAACCTATCACTGTCACGTCA; Fasn hacia adelante: GGAGGTGGTGATAGCCGGTAT, Fasn hacia atrás: TGGGTAATCCATAGAGCCCAG; Fdft1 hacia adelante: GTTTGAAGACCCCATAGTTGGTG, Fdft1 hacia atrás: CACATCTACGTTCTCTGGCTTAG; Fdps hacia adelante: GGAGGTCCTAGAGTACAATGCC, Fdps hacia atrás: AAGCCTGGAGCAGTTCTACAC; Ggps1 hacia adelante: TTCACAGGCATTTAATCACTGGC, Ggps1 hacia atrás: ACCACGTCGGAGCTTTGAAC; Gldc hacia adelante: CTCCTGCCCAGACACGAT, Gldc hacia atrás: GGGACCGTCTTCTCGATGAG; Gpat1 adelante: CTTGGCCGATGTAAACACACC, Gpat1 atrás: CTTCCGGCTCATAAGGCTCTC; Gpat4 hacia adelante: TCAAAGAAATTCGTCGAAGTGGT, Gpat4 hacia atrás: CCTTTCCCGGCAAAAGTAGAAGAT; Hmgcs1 hacia adelante: AACTGGTGCAGAAATCTCTAGC, Hmgcs1 hacia atrás: GGTTGAATAGCTCAGAACTAGCC; Hmgcr hacia adelante: AGCTTGCCCGAATTGTATGTG, Hmgcr hacia atrás: TCTGTTGTGAACCATGTGACTTC; Lss adelante: TCGTGGGGGACCCTATAAAAC, Lss reverso: CGTCCTCCGCTTGATAATAAGTC; Mthfd1 adelante: CTCCTGTCCCAAGTGACATTG, Mthfd1 reverso: TAGCCTTCGTTTCCCCGTACA; Mthfd2 adelante: AGTGCGAAATGAAGCCGTTG, Mthfd2 reverso: GACTGGCGGGATTGTCACC; Mthfd1l adelante: GCATGGCCTTACCCTTCAGAT, Mthfd1l reverso: GTACGAGCTTCCCCAGATTGA; Mthfd2l adelante: AAGGACGTTGATGGATTTCACAT, Mthfd2l reverso: GATGATTTCCCAAACGGCACT; Mthfr adelante: AGATGAGGCGCAGAATGGAC, Mthfr reverso: CATCCGGTCAAACCTGGAGAT; Mtr hacia adelante: TCCTCCTCGGCCTATCTTTATTT, Mtr hacia atrás: GGTCCGAATGAGACACGCT; Mvk hacia adelante: GGTGTGGTCGGAACTTCCC, Mvk hacia atrás: CCTTGAGCGGGTTGGAGAC; Mvd hacia adelante: ATGGCCCTCAGAAAAGCCTCAG, Mvd hacia atrás: TGGTCGTTTTTAGCTGGTCCT; Pmvk adelante: CCTATGGGGCTGTGATACAGA, Pmvk reverso: TCTCCGTGGTTCTCAATGACC; Psat hacia adelante: CAGTGGAGCGCCAGAATAGAA, Psat hacia atrás: CCTGTGCCCCTTCAAGGA; Psph hacia adelante: TGAGTACCGCAGGTTTTGATGAG, Psph hacia atrás: TGAGTACCGCAGGTTTTGATGAG; Phgdh hacia adelante: ATGGCCTTCGCAAAATCTGC, Phgdh hacia atrás: AGTTCAGCTATCAGCTCCTCC; Scd1 adelante: TTCTTGCGATACACTCTGGTGC, Scd2 atrás: CGGGATTGAATGTTTTGTCGT; Scd2 adelante: GATCTCTGGCGCTTACTCAGC, Scd2 atrás: CTCCCCAGTGGTGAGAACTC; Sds hacia adelante: GAAGACCCCACTTCGTGACAG, Sds hacia atrás: TCTTGCAGAGATGCCCAATGC; Shmt1 hacia adelante: CAGGGCTCTGCTTGATGCAC, Shmt1 hacia atrás: CGTAACGCGCTCTTGTCAC; Shmt2 adelante: TGGCAAGAGATACTACGGAGG, Shmt2 reverso: AGATCCGCTTGACATCAGACA; Sqle hacia adelante: ATAAGAAATGCGGGGATGTCAC, Sqle hacia atrás: ATATCCGAGAAGGCAGCGAAC; Srebp1a adelante: TAGTCCGAAGCCGGGTGGCGCCGG, Srebp1a reverso: GATGTCGTTCAAAACCGCTGTGTGTC; Srebp1c adelante: AAGCAAATCACTGAAGGACCTGG, Srebp1c reverso: AAAGACAAGCTACTCTGGGAG; Srebp2 adelante: GGATCCTCCCAAAGAAGGAG, Srebp2 reverso: TTCCTCAGAACGCCAGACTT; Tyms hacia adelante: GGAAGGGTGTTTTGGAGGAGT, Tyms hacia atrás: GCTGTCCAGAAAATCTCGGGA.

Para comparar los niveles de proteína en el tejido, se homogeneizaron ~20 mg de tejido en tampón RIPA suplementado con una solución de EDTA 5 mM (Thermo Scientific), un cóctel de inhibidor de proteasa (cOmplete, Roche) y un cóctel de inhibidor de fosfatasa (PhosSTOP, Roche), y se colocaron en hielo durante 30 minutos. El lisado de tejido se centrifugó a 13.000 g durante 10 minutos a 4 °C y el sobrenadante se almacenó a -80 °C. El contenido de proteína homogeneizada se determinó utilizando el ensayo de ácido bicinconínico (Thermo Scientific). Las muestras de proteínas se prepararon en un tampón Laemmli (NuPAGE LDS Sample Buffer, Life Technologies) y se procesaron en un gel prefabricado al 4-15 % (Mini-PROTEAN TGX, Bio-Rad) durante 2 h a 100 V constantes y se transfirieron a un difluoruro de polivinilideno. (PVDF) durante 2 h a 250 mA constantes en un tanque de transferencia enfriado con hielo. La membrana se bloqueó con leche al 5% y se incubó durante la noche a 4 °C con un anticuerpo primario contra ACLY (Cell Signaling 13390, 1:1000), ACC (Cell Signaling 3662, 1:2000), p-AKT Ser473 (Cell Signaling 9271 , 1:1.000), p-AKT Ser308 (Señalización celular 9275, 1:1.000), AKT (Señalización celular 75692, 1:1.000), SCD1 (Señalización celular 2794, 1:1.000), GAPDH (Señalización celular 5174, 1: 4000) y vinculina (Cell Signaling 4650, 1:1000). Después de lavar con TBS-T, las membranas se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (Cell Signaling 7074, 1:5000) durante 1 h a temperatura ambiente y se incubaron con líquido de quimioluminiscencia mejorado (Clarity Western ECL Substrate, Bio-Rad) durante 5 minutos. La cuantificación de la densitometría se realizó utilizando el software Image Lab (Bio-Rad). Para escaneos sin procesar con marcadores de peso molecular, consulte la Figura complementaria 1.

Los datos se expresan como media ± sem a menos que se indique lo contrario. El análisis estadístico se realizó con el software Prism (GraphPad Prism 9.3.1) utilizando una prueba t independiente bilateral para comparar dos grupos, ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de la diferencia menos significativa de Fisher para comparar más de dos grupos, ANOVA bidireccional. con la prueba post hoc de diferencia menos significativa de Fisher para comparar el diseño del estudio de dos factores y el análisis PERMANOVA para explorar los gráficos RPCA. Para todas las pruebas, P <0,05 se consideró significativo. Todos los puntos de datos del manuscrito representan réplicas biológicas individuales. No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de origen para los algoritmos de microbioma y las inmunotransferencias se proporcionan como información complementaria. Los datos sin procesar de la secuenciación del genoma del microbioma completo se cargaron en Qiita53, donde seguimos el flujo de trabajo de procesamiento predeterminado. Los datos de datos de espectrometría de masas dirigida y de alta resolución están disponibles en el sitio web del Repositorio Nacional de Datos de Metabolómica (NMDR) del Fondo Común de los NIH, Metabolomics Workbench, https://www.metabolomicsworkbench.org, donde se le ha asignado el ID de proyecto M8JD81 (https:/ /doi.org/10.21228/M8JD81). Se puede acceder a los datos directamente a través del ID de proyecto M8JD81. Los datos adicionales que respaldan los hallazgos están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Agradecemos a todos los miembros del laboratorio Metallo por sus útiles debates, así como a M. Friedlander, E. Holmes y A. Tayerani por sus aportes. Este trabajo fue apoyado por los NIH (R01CA234245 para CMM, NIDDK MICROMouse Funding DK076169 para MKH y R01AG065993 para AC), un premio Camille and Henry Dreyfus Teacher-Scholar (para CMM), Lowy Medical Research Institute (para CMM) y el American Asociación del Corazón (18CDA34110292 a AC). Este trabajo también fue apoyado por la subvención del Centro de Investigación de Enfermedades Digestivas de San Diego financiada por el NIDDK (P30 DK120515).

Laboratorio de Biología Molecular y Celular, Instituto Salk de Estudios Biológicos, La Jolla, CA, EE. UU.

Michal K. Handzlik, Jivani M. Gengatharan, Grace H. McGregor, Courtney R. Green, Patrick Tseng y Christian M. Metallo

Departamento de Bioingeniería, Universidad de California San Diego, La Jolla, CA, EE. UU.

Michal K. Handzlik, Jivani M. Gengataran, Grace H. McGregor, Ana M. Moreno, Courtney R. Green, Prashant Mali, Rob Knight y Christian M. Metallo

Departamento de Patología, Facultad de Medicina, Universidad de California en San Diego, La Jolla, CA, EE. UU.

Katie E. Frizzi, Lucie S. Guernsey y Nigel A. Calcutt

Departamento de Pediatría, Facultad de Medicina, Universidad de California en San Diego, La Jolla, CA, EE. UU.

Cameron Martino, Gibraan Rahman, Antonio González y Rob Knight

Programa de Bioinformática y Biología de Sistemas, Universidad de California en San Diego, La Jolla, CA, EE. UU.

Cameron Martino, Gibraan Rahman y Rob Knight

Centro para la Innovación en Microbiomas, Universidad de California en San Diego, La Jolla, CA, EE. UU.

Cameron Martino y Rob Caballero

Laboratorio de Biología Reguladora, Instituto Salk de Estudios Biológicos, La Jolla, CA, EE. UU.

Terry Lin y Satchidananda Panda

Scripps Research, La Jolla, California, EE. UU.

Yoichiro Ideguchi

Instituto de Investigación Médica Lowy, La Jolla, California, EE. UU.

Regis J. Fallon y Marin L. Gantner

Departamento de Nutrición y Fisiología Integrativa, Universidad de Utah, Salt Lake City, UT, EE. UU.

Amandine Chaix

Escuela de Agricultura y Ciencias de los Alimentos, University College Dublin, Dublín, Irlanda

Martina Wallace

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MKH y CMM diseñaron el estudio. MKH, JMG, AMM, YI, KEF, LSG, PT y RJF realizaron ensayos de comportamiento, GTT e ITT. MKH, GHM y CRG generaron y analizaron trazadores de isótopos estables y datos de metabolómica y lipidómica específicos. CM, GR y AG realizaron análisis de microbioma, incluida la diversidad filogenética alfa y beta y el análisis de vías. TL y AC realizaron experimentos de calorimetría con bombas fecales. SP, MW, PM, RK, MLG, NAC y CMM guiaron el diseño y análisis experimental. MKH y CMM escribieron el manuscrito con aportaciones de todos los autores.

Correspondencia a Christian M. Metallo.

CMM es asesor científico de Faeth Therapeutics. Los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

Nature agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

(a) Niveles de glicina, serina y metionina en ratones WT y BKS-db/db en el riñón (n = 6 por grupo). (b) Niveles de glicina, serina y metionina en ratones WT y BKS-db/db en el tejido adiposo inguinal (iWAT) (n = 6 por grupo). (c) Niveles de metabolitos plasmáticos en ratones WT y BKS-db/db (n = 6 por grupo). (d) expresión de ARNm de enzimas renales que regulan la serina, la glicina y el metabolismo de un carbono en ratones WT (n = 6) y BKS-db/db (n = 5). (e) Prueba de tolerancia a la serina (STT) en ratones C57BL/6J después de un ayuno nocturno (n = 4 por dosis). ( f ) Fracción de etiquetado de serina tisular en ratones WT 15 minutos después de la administración de serina [U-13C3] mediante sonda oral (n = 4 por tejido) después de un ayuno nocturno. ( g ) Fracción de etiquetado de citrato tisular en ratones WT 15 minutos después de la administración de serina [U-13C3] mediante sonda oral (n = 4 por tejido) después de un ayuno nocturno. Los datos son media ± error estándar de la media (SEM) y se analizaron mediante una prueba t independiente de dos caras (a – d). * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001 frente al grupo WT.

( a ) Actividad de serina deshidratasa determinada en el hígado y el riñón en ratones C57BL/6J en estado alimentado (n = 5 por tejido). (b) Insulina sérica en ratones WT y BKS-db/db cuantificada después de un ayuno de 6 h (n = 6 por grupo). (c) Glucagón sérico en ratones WT (n = 5) y BKS-db/db (n = 6) cuantificados después de un ayuno de 6 h. (d) Farmacocinética de la glucosa plasmática y área bajo la curva (AUCGLC) en ratones WT y BKS-db/db después de GTT/STT con glucosa dosificada a 2 g/kg (n = 6 por grupo) después de un ayuno nocturno. (e) Farmacocinética de la glicina plasmática y área bajo la curva (AUCGLY) en ratones WT y BKS-db/db después de GTT/STT con glucosa dosificada a 2 g/kg (n = 6 por grupo) después de un ayuno nocturno. (f) Prueba de tolerancia a la serina (STT) y área bajo la curva (AUCSER) en ratones WT y BKS-db/db (n = 6 por grupo) a los que se les administró serina (400 mg/kg) solo después de un ayuno nocturno. (g) Nivel de insulina plasmática en ayunas (6 h) en ratones C57BL/6J tratados con vehículo o estreptozotocina (STZ) 1 semana después de la inyección (n = 9 por grupo). (h) Glicemia en ayunas (6 h) en ratones C57BL/6J tratados con vehículo o estreptozotocina (STZ) 1 semana después de la inyección (n = 9 por grupo). (i) Contenido de masa grasa corporal en ratones C57BL/6J tratados con vehículo o estreptozotocina (STZ) 1 semana después de la inyección (n = 9 por grupo). (j) Concentración de aminoácidos en plasma en ayunas (6 h) en ratones C57BL/6J tratados con vehículo (n = 9) o estreptozotocina (STZ, n = 10) 1 semana después de la inyección. (k) Farmacocinética de la glucosa plasmática y área bajo la curva (AUCGLC) después de un ayuno nocturno durante GTT/STT en ratones C57BL/6J tratados con vehículo (n = 7) o estreptozotocina (STZ, n = 6) 2 semanas después de las inyecciones con glucosa dosificada a 2 g/kg. (l) Latencia térmica en ratones WT y BKS-db/db de 14 semanas (n = 6 por grupo). (m) Detección táctil en ratones WT y BKS-db/db de 14 semanas de edad (n = 6 por grupo). (n) Velocidad de conducción del nervio motor en ratones WT y BKS-db/db de 14 semanas de edad (n = 6 por grupo). Los datos son media ± error estándar de la media (SEM) y se analizaron mediante una prueba t independiente bilateral (b–n) y un ANOVA bidireccional con la prueba post hoc LSD de Fisher (experimentos e–f, k en el transcurso del tiempo). ).

(a) Nivel de aminoácidos en plasma en estado de alimentación en ratones alimentados con una dieta baja en grasas (LFD, n = 5), LFD sin serina/glicina (-SG LFD, n = 8), dieta alta en grasas (HFD, n = 8) y HFD sin serina/glicina (-SG HFD, n = 8) durante 18 semanas. (b) Contenido de metabolitos hepáticos en ratones alimentados con una dieta baja en grasas (LFD, n = 10), LFD sin serina/glicina (-SG LFD, n = 10), dieta alta en grasas (HFD, n = 10), y HFD sin serina/glicina (-SG HFD, n = 10) durante 18 semanas. (c) Aumento de peso corporal 18 semanas después de la intervención dietética (n = 13 por grupo). (d) Ingesta de alimentos en respuesta a una alimentación dietética de 18 semanas en ratones con una dieta baja en grasas (LFD, n = 10), LFD sin serina/glicina (-SG LFD, n = 12), dieta alta en grasas (HFD , n = 13), y HFD sin serina/glicina (-SG HFD, n = = 13). (e) Ingesta de calorías en respuesta a una alimentación dietética de 18 semanas en ratones con una dieta baja en grasas (LFD, n = 10), LFD sin serina/glicina (-SG LFD, n = 12), dieta alta en grasas (HFD , n = 13), y HFD sin serina/glicina (-SG HFD, n = 13). (f) Absorción de calorías en respuesta a una alimentación dietética de 18 semanas en ratones con una dieta baja en grasas (LFD, n = 10), LFD sin serina/glicina (-SG LFD, n = 12), dieta alta en grasas (HFD , n = 13), y HFD sin serina/glicina (-SG HFD, n = 13). (g) Ingesta de agua en respuesta a una alimentación dietética de 18 semanas en ratones con una dieta baja en grasas (LFD, n = 10), LFD sin serina/glicina (-SG LFD, n = 12), dieta alta en grasas (HFD , n = 13), y HFD sin serina/glicina (-SG HFD, n = 13). (h) Actividad física en respuesta a una alimentación dietética de 18 semanas en ratones con una dieta baja en grasas (LFD, n = 10), LFD sin serina/glicina (-SG LFD, n = 12), dieta alta en grasas (HFD , n = 13), y HFD sin serina/glicina (-SG HFD, n = 13). (i) Imágenes representativas y cuantificación del tamaño de los adipocitos en respuesta a una alimentación dietética de 18 semanas en ratones con una dieta baja en grasas (LFD, n = 10), LFD sin serina/glicina (-SG LFD, n = = 12) , dieta alta en grasas (HFD, n = 13) y HFD sin serina/glicina (-SG HFD, n = 13). (j) Prueba de tolerancia a la glucosa IP 18 semanas después de la alimentación con una dieta baja en grasas (LFD) o una dieta alta en grasas (HFD) repleta o deficiente en serina y glicina (n = 13 por grupo). (k) Prueba de tolerancia a la insulina IP 18 semanas después de la alimentación con una dieta baja en grasas (LFD) o una dieta alta en grasas (HFD) repleta o deficiente en serina y glicina (n = 15 por grupo). (l) Curso temporal del índice de intercambio respiratorio 18 semanas después de alimentar a los ratones con una dieta baja en grasas (LFD, n = 10), LFD sin serina/glicina (-SG LFD, n = 12), dieta alta en grasas (HFD, n = 13) y HFD sin serina/glicina (-SG HFD, n = = 13). Los datos son media ± error estándar de la media (SEM) y se analizaron mediante un ANOVA de dos factores con la prueba post hoc LSD de Fisher (a-k). * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001 frente a LFD. # P < 0,05 frente al grupo HFD.

(a) Análisis sólido de componentes principales de la diversidad beta del microbioma 18 semanas después de alimentar a los ratones con una dieta baja en grasas (LFD, n = 10), LFD sin serina/glicina (-SG LFD, n = 10), dieta alta en grasas (HFD, n = 9) y HFD sin serina/glicina (-SG HFD, n = 9). (b) Relación logarítmica de especies con vías completas versus vías incompletas para la biosíntesis de L-serina 18 semanas después de alimentar ratones con una dieta baja en grasas (LFD, n = 10), LFD sin serina/glicina (-SG LFD, n = 10), dieta alta en grasas (HFD, n = 9) y HFD sin serina/glicina (-SG HFD, n = 9). (c) Relación logarítmica de especies con vías completas versus incompletas para la escisión de glicina 18 semanas después de alimentar ratones con una dieta baja en grasas (LFD, n = 10), LFD sin serina/glicina (-SG LFD, n = 10) , dieta alta en grasas (HFD, n = 9) y HFD sin serina/glicina (-SG HFD, n = 9). (d) Registrar el cambio de especies de microbioma 18 semanas después de alimentar a los ratones con una dieta baja en grasas (LFD, n = 10), LFD sin serina/glicina (-SG LFD, n = 10), dieta alta en grasas (HFD, n = 9) y HFD sin serina/glicina (-SG HFD, n = 9). Los datos se presentan como mínimo/máximo (b – c) y se analizaron mediante una prueba PERMANOVA (a) y un ANOVA de dos factores con la prueba post hoc LSD de Fisher (b – c).

(a) Enriquecimiento de agua pesada en plasma (D2O) en ratones alimentados con una dieta baja en grasas (LFD, n = 3), LFD sin serina/glicina (-SG LFD, n = 4), dieta alta en grasas (HFD, n = 5) y HFD sin serina/glicina (-SG HFD, n = 5). (b) Síntesis de colesterol de novo en ratones alimentados con LFD (n = 3), -SG LFD (n = 4), HFD (n = 5) y -SG HFD (n = 5) durante 18 semanas. (c) Expresión de proteínas hepáticas de ATP-citrato liasa (ACLY), acetil-CoA carboxilasa (ACC) y esteroil-CoA desaturasa 1 (SCD1), P-AktS473 y P-AktT308 (n = 3 por grupo). (d) Expresión de ARNm hepático de ATP-citrato liasa (Acly), acetil-CoA carboxilasa (Acc2) y esteroil-CoA desaturasa 1 (Scd1) en ratones alimentados con una dieta baja en grasas (LFD, n = 8), serina/ LFD sin glicina (-SG LFD, n = 11), dieta alta en grasas (HFD, n = 13) y HFD sin serina/glicina (-SG HFD, n = 10). (e) Expresión de ARNm hepático de enzimas implicadas en la síntesis de ácidos grasos y colesterol en ratones alimentados con una dieta baja en grasas (LFD, n = 8), LFD sin serina/glicina (-SG LFD, n = 11), dieta alta en grasas (HFD, n = 13) y HFD sin serina/glicina (-SG HFD, n = 10). Los datos son media ± error estándar de la media (SEM) y se analizaron mediante un ANOVA de dos factores con la prueba post hoc LSD de Fisher (a-e). * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001 frente a LFD. # P < 0,05 frente al grupo HFD.

(a) Cuantificación de la latencia térmica en ratones C57BL/6J alimentados con una dieta de control (n = 10) o sin serina/glicina (-Ser/Gly, n = 10) durante 12 meses. (b) Imágenes representativas de la densidad de la fibra nerviosa intraepidérmica (IENF) y cuantificación de IENF en la piel de la pata de ratones alimentados con una dieta de control (n = 2) o sin serina/glicina (n = 3) durante 12 meses. La tinción con PGP9.5 de IENF se muestra mediante flechas. (c) Evolución del peso corporal en ratones alimentados con una dieta baja en grasas + vehículo (LFD+Veh, n = 10), LFD + 0,3 mg/kg de miriocina (LFD+Myr, n = 10), LFD sin serina/glicina + vehículo (-SG LFD+Veh, n = 10), -SG LFD + miriocina (-SG LFD+Myr, n = 9), dieta alta en grasas + vehículo (HFD+Veh, n = 10), HFD + miriocina ( HFD+Myr, n = 10), HFD sin serina/glicina + vehículo (-SG HFD+Veh, n = 10) y -SG HFD + miriocina (-SG HFD+Myr, n = 9). (d) Aumento de peso corporal 6 meses después de la intervención dietética en ratones alimentados con una dieta baja en grasas + vehículo (LFD+Veh, n = 10), LFD + 0,3 mg/kg de miriocina (LFD+Myr, n = 10), serina/ LFD sin glicina + vehículo (-SG LFD+Veh, n = 10), -SG LFD + miriocina (-SG LFD+Myr, n = 9), dieta alta en grasas + vehículo (HFD+Veh, n = 10), HFD + miriocina (HFD+Myr, n = 10), HFD sin serina/glicina + vehículo (-SG HFD+Veh, n = 10) y -SG HFD + miriocina (-SG HFD+Myr, n = 9) . (e) Tamaño del tejido adiposo 6 meses después de la intervención dietética en ratones alimentados con una dieta baja en grasas + vehículo (LFD+Veh, n = 9), LFD + 0,3 mg/kg de miriocina (LFD+Myr, n = 10), serina/ LFD sin glicina + vehículo (-SG LFD+Veh, n = 10), -SG LFD + miriocina (-SG LFD+Myr, n = 9), dieta alta en grasas + vehículo (HFD+Veh, n = 10), HFD + miriocina (HFD+Myr, n = 10), HFD sin serina/glicina + vehículo (-SG HFD+Veh, n = 10) y -SG HFD + miriocina (-SG HFD+Myr, n = 9) . (f) Concentración de aminoácidos en plasma 6 meses después de la intervención dietética en ratones alimentados con una dieta baja en grasas + vehículo (LFD+Veh, n = 10), LFD + 0,3 mg/kg de miriocina (LFD+Myr, n = 10), serina /LFD sin glicina + vehículo (-SG LFD+Veh, n = 10), -SG LFD + miriocina (-SG LFD+Myr, n = 9), dieta alta en grasas + vehículo (HFD+Veh, n = 10) , HFD + miriocina (HFD+Myr, n = 10), HFD sin serina/glicina + vehículo (-SG HFD+Veh, n = 10) y -SG HFD + miriocina (-SG HFD+Myr, n = 9 ). (g) Gráfico de pila de ceramidas hepáticas en ratones alimentados con una dieta baja en grasas + vehículo (LFD+Veh, n = 10), LFD + 0,3 mg/kg de miriocina (LFD+Myr, n = 10), sin serina/glicina LFD + vehículo (-SG LFD+Veh, n = 10), -SG LFD + miriocina (-SG LFD+Myr, n = 9), dieta alta en grasas + vehículo (HFD+Veh, n = 10), HFD + miriocina (HFD+Myr, n = 10), HFD sin serina/glicina + vehículo (-SG HFD+Veh, n = 10) y -SG HFD + miriocina (-SG HFD+Myr, n = 9). (h) Gráfico de pila de ceramidas del nervio ciático en ratones alimentados con una dieta baja en grasas + vehículo (LFD+Veh, n = 10), LFD + 0,3 mg/kg de miriocina (LFD+Myr, n = 10), serina/glicina- LFD libre + vehículo (-SG LFD+Veh, n = 10), -SG LFD + miriocina (-SG LFD+Myr, n = 9), dieta alta en grasas + vehículo (HFD+Veh, n = 10), HFD + miriocina (HFD+Myr, n = 10), HFD sin serina/glicina + vehículo (-SG HFD+Veh, n = 10) y -SG HFD + miriocina (-SG HFD+Myr, n = 9). (i) Gráfico de pila de desoxidihidroceramida (desoxiDHCer) del nervio ciático en ratones alimentados con una dieta baja en grasas + vehículo (LFD+Veh, n = 10), LFD + 0,3 mg/kg de miriocina (LFD+Myr, n = 10), serina /LFD sin glicina + vehículo (-SG LFD+Veh, n = 10), -SG LFD + miriocina (-SG LFD+Myr, n = 9), dieta alta en grasas + vehículo (HFD+Veh, n = 10) , HFD + miriocina (HFD+Myr, n = 10), HFD sin serina/glicina + vehículo (-SG HFD+Veh, n = 10) y -SG HFD + miriocina (-SG HFD+Myr, n = 9 ). Los datos son media ± error estándar de la media (SEM) y se analizaron mediante un ANOVA de dos factores con la prueba post hoc de LSD de Fisher (a y c) y un ANOVA de un factor con la prueba post hoc de LSD de Fisher (d – i). Los análisis estadísticos en gi se realizaron utilizando la suma de las abundancias de esfingolípidos.

(a) Imágenes representativas de la densidad de las fibras nerviosas intraepidérmicas (IENF) en ratones alimentados con una dieta baja en grasas + vehículo (LFD+Veh, n = 10), una dieta alta en grasas + vehículo (HFD+Veh, n = 7), serina/ HFD libre de glicina + vehículo (-SG HFD+Veh, n = 12), y -SG HFD + miriocina (-SG HFD+Myr, n = 8). (b) Imágenes representativas y cuantificación de los nervios corneales en ratones alimentados con una dieta baja en grasas + vehículo (LFD+Veh, n = 12), una dieta alta en grasas + vehículo (HFD+Veh, n = 12), sin serina/glicina HFD + vehículo (-SG HFD+Veh, n = 12), y -SG HFD + miriocina (-SG HFD+Myr, n = 11). (c) Detección táctil en ratones alimentados con una dieta baja en grasas + vehículo (LFD+Veh, n = 12), una dieta alta en grasas + vehículo (HFD+Veh, n = 12), HFD sin serina/glicina + vehículo (- SG HFD+Veh, n = 12), y -SG HFD + miriocina (-SG HFD+Myr, n = 11). (d) Velocidad de conducción nerviosa motora en ratones alimentados con una dieta baja en grasas + vehículo (LFD+Veh, n = 12), una dieta alta en grasas + vehículo (HFD+Veh, n = 12), HFD sin serina/glicina + vehículo (-SG HFD+Veh, n = 12), y -SG HFD + miriocina (-SG HFD+Myr, n = 11). (e) Análisis de lipidómica de alta resolución del hígado en estado alimentado en ratones alimentados con una dieta baja en grasas + vehículo (LFD+Veh, n = 12), dieta alta en grasas + vehículo (HFD+Veh, n = 12), serina/ vehículo HFD + libre de glicina (-SG HFD+Veh, n = 12), y -SG HFD + miriocina (-SG HFD+Myr, n = 11). Los datos son media ± error estándar de la media (SEM) y se analizaron mediante un ANOVA unidireccional con la prueba post hoc LSD de Fisher (b-e).

a) Concentración de deoxiesfinganina plasmática hidrolizada (deoxySA) en ratones WT y BKS-db/db de 16 semanas de edad (n = 6 por grupo). b) Determinación de esfingolípidos dirigidos al hígado en ratones WT y BKS-db/db de 16 semanas de edad (n = 6 por grupo). c) Curso temporal de latencia térmica en ratones BKS-db/db tratados con vehículo (n = 10) o miriocina (0,3 mg/kg en días alternos, n = 9) durante 8 semanas. d) Detección táctil en ratones BKS-db/db tratados con vehículo (n = 10) o miriocina (n = 9) durante 8 semanas. e) Densidad de fibras nerviosas intraepidérmicas en ratones BKS-db/db tratados con vehículo (n = 10) o miriocina (n = 9) durante 8 semanas. f) Evolución del peso corporal en ratones BKS-db/db tratados con vehículo (n = 10) o miriocina (n = 9) durante 8 semanas. g) Curso temporal de glucosa en sangre en ayunas (6 h) en ratones BKS-db/db tratados con vehículo (n = 10) o miriocina (n = 9) durante 8 semanas. h) Serina plasmática en ayunas (6 h) en ratones BKS-db/db tratados con vehículo (n = 10) o miriocina (n = 8) durante 8 semanas. i) Esfingolípidos hepáticos sumados en ratones BKS-db/db tratados con vehículo (n = 10) o miriocina (n = 9) durante 8 semanas. j) Esfingolípidos sumados de la piel de la pata en ratones BKS-db/db tratados con vehículo (n = 10) o miriocina (n = 9) durante 8 semanas. k) Gráfico de pila de especies de desoxidihidroceramida hepática (desoxiDHCer) en ratones BKS-db/db tratados con vehículo (n = 10) o miriocina (n = 9) durante 8 semanas. l) Gráfico de apilados de especies de desoxidihidroceramida (deoxyDHCer) de la piel de la pata en ratones BKS-db/db tratados con vehículo (n = 10) o miriocina (n = 9) durante 8 semanas. m) Gráfico de pila de especies de esfingomielina hepática (SM) en ratones BKS-db/db tratados con vehículo (n = 10) o miriocina (n = 9) durante 8 semanas. n) Gráfico de apilados de especies de esfingomielina (SM) de piel de pata en ratones BKS-db/db tratados con vehículo (n = 10) o miriocina (n = 9) durante 8 semanas. Los datos son media ± error estándar de la media (SEM) y se analizaron mediante una prueba t independiente bilateral (a–b,d–e, i–n) y un ANOVA bidireccional con la prueba post hoc LSD de Fisher (c ,f–h). Los análisis estadísticos en kn se realizaron utilizando la suma de las abundancias de esfingolípidos.

a) Evolución del peso corporal en ratones BKS-db/db alimentados con una dieta de control (n = 8) o suplementada con serina (n = 9) durante 8 semanas. b) Curso temporal de glucosa en sangre en ayunas (6 h) en BKS-db/db alimentados con una dieta de control (n = 8) o suplementada con serina (n = 9) durante 8 semanas. c) Esfingolípidos hepáticos sumados en ratones BKS-db/db alimentados con una dieta de control o suplementada con serina durante 8 semanas (n = 8 por grupo). d) Esfingolípidos sumados de la piel de la pata en ratones BKS-db/db alimentados con una dieta de control o suplementada con serina durante 8 semanas (n = 8 por grupo). e) Niveles de especies de esfingomielina (SM) en el hígado en ratones BKS-db/db alimentados con una dieta de control o suplementada con serina durante 8 semanas (n = 8 por grupo). f) Niveles de especies de esfingomielina (SM) en la piel de la pata de ratones BKS-db/db alimentados con una dieta de control o suplementada con serina durante 8 semanas (n = 8 por grupo). Los datos son media ± error estándar de la media (SEM) y se analizaron con un ANOVA de dos factores con la prueba post hoc LSD de Fisher (a–b) y una prueba t independiente bilateral (c–f). Los análisis estadísticos en ef se realizaron utilizando abundancias sumadas.

La figura complementaria 1 contiene las imágenes de transferencia Western sin procesar.

Composición dietética.

Transiciones LC-MS/MS.

Transiciones de espectrometría de masas de alta resolución.

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Handzlik, MK, Gengatharan, JM, Frizzi, KE et al. El metabolismo de la serina y los lípidos regulado por la insulina impulsa la neuropatía periférica. Naturaleza 614, 118-124 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05637-6

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Recibido: 20 de diciembre de 2021

Aceptado: 07 de diciembre de 2022

Publicado: 25 de enero de 2023

Fecha de emisión: 02 de febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05637-6

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