Efectos del ejercicio sobre NAFLD utilizando no

Jul 23, 2023

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 6485 (2022) Citar este artículo

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Los mecanismos por los cuales el ejercicio beneficia a los pacientes con enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), la enfermedad hepática más común en todo el mundo, siguen siendo poco conocidos. Se utilizó un análisis metabolómico basado en cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) no dirigido para identificar cambios metabólicos asociados con NAFLD en humanos tras una intervención de ejercicio (sin cambio de dieta) en cuatro tipos diferentes de muestras: tejido adiposo (AT), plasma , orina y heces. En total, 46 sujetos con NAFLD participaron en este estudio de intervención controlado aleatorio. El grupo de intervención (n = 21) realizó entrenamiento en intervalos de alta intensidad (HIIT) durante 12 semanas, mientras que el grupo de control (n = 25) mantuvo su estilo de vida sedentario. Los parámetros clínicos y los perfiles metabólicos de los participantes se compararon entre el inicio y el final. El HIIT disminuyó significativamente la concentración de glucosa plasmática en ayunas (p = 0,027) y la circunferencia de la cintura (p = 0,028); y aumento de la tasa máxima de consumo de oxígeno y de la carga de trabajo máxima alcanzada (p < 0,001). El HIIT produjo cambios en los metabolitos específicos del tipo de muestra, incluida la acumulación de aminoácidos y sus derivados en AT y plasma, mientras que disminuyó en la orina y las heces. Además, muchos de los cambios en los niveles de metabolitos, especialmente en el AT, se correlacionaron con los parámetros clínicos monitorizados durante la intervención. Además, ciertos lípidos aumentaron en el plasma y disminuyeron en las heces. Los ácidos biliares glicoconjugados disminuyeron en AT y orina. La intervención de ejercicio HIIT de 12 semanas tiene efectos beneficiosos de mejora en sujetos con NAFLD a nivel de todo el cuerpo, incluso sin cambios en la dieta ni pérdida de peso. El análisis metabolómico aplicado a las cuatro matrices de muestra diferentes proporcionó una visión general de varias vías metabólicas que tuvieron cambios específicos del tipo de tejido después de la intervención HIIT en sujetos con NAFLD. Los resultados resaltan especialmente el papel de la AT en la respuesta al desafío HIIT y sugieren que el metabolismo alterado de los aminoácidos en la AT podría desempeñar un papel crítico, por ejemplo, en la mejora de la concentración de glucosa plasmática en ayunas.

Registro de ensayo ClinicalTrials.gov (NCT03995056).

Aproximadamente el 25% de la población mundial se ve afectada por la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), lo que la convierte en la enfermedad hepática más común en todo el mundo y un importante problema de salud pública1,2. La NAFLD abarca afecciones hepáticas que van desde la esteatosis hasta la esteatohepatitis y la cirrosis hepática3. La NAFLD también se asocia con la resistencia a la insulina y con componentes del síndrome metabólico, incluida la obesidad, la diabetes tipo 2 (DT2) y la hiperlipidemia, lo que convierte a la NAFLD en una enfermedad multisistémica4.

El ejercicio físico es una terapia de primera línea para pacientes con NAFLD. Los estudios clínicos centrados en intervenciones de ejercicio físico han demostrado que el ejercicio disminuye el peso, la circunferencia de la cintura, la grasa corporal y la presión arterial en pacientes con EHGNA5. Además, los parámetros clínicos de NAFLD, como el contenido de lípidos intrahepáticos (IHL), la sensibilidad a la insulina y las enzimas hepáticas como la alanina aminotransaminasa (ALT) y la aspartato aminotransaminasa (AST) también han mejorado con el ejercicio físico6,7,8,9,10. . Además, los cambios en los niveles de metabolitos endógenos y producidos por la microbiota intestinal, incluidos purina, triptófano, carnitina y metabolitos esteroides, inducidos por el ejercicio físico, pueden ser parcialmente responsables de los beneficios para la salud relacionados con el ejercicio11,12. Sin embargo, los mecanismos detrás de tales mejoras y la contribución de estos metabolitos en el contexto de NAFLD no se conocen bien.

La tecnología de metabolómica de alto rendimiento tiene el potencial de ofrecer una visión integral de los cambios metabólicos relacionados con la NAFLD y, de hecho, ya ha propuesto varios biomarcadores para la NAFLD, incluidos aminoácidos, ácidos biliares, fosfocolinas, carbohidratos y metabolitos producidos por la microbiota intestinal, como el succínico. ácido, ácido fenilacético y ácido 3-(4-hidroxifenil)láctico13,14,15,16,17. El perfil de metabolitos no dirigidos también podría servir como una herramienta valiosa para evaluar las diferencias metabólicas entre los pacientes con NAFLD en respuesta al ejercicio y puede ayudar a descubrir un amplio espectro de metabolitos microbianos endógenos y intestinales alterados durante el ejercicio. En este estudio, utilizamos un enfoque de metabolómica no dirigida para identificar cambios metabólicos asociados con NAFLD en humanos durante el entrenamiento en intervalos de alta intensidad (HIIT) en cuatro matrices de muestra diferentes: tejido adiposo (AT), plasma, orina y heces. Esto permitirá comprender la naturaleza compleja de los beneficios relacionados con el ejercicio para la salud a nivel de todo el cuerpo, combinando la interacción de la microbiota intestinal, la circulación, la excreción y el metabolismo de los tejidos.

Los sujetos (n = 46) fueron asignados aleatoriamente a dos grupos de estudio (intervención n = 21; control n = 25) según las medianas del índice de masa corporal (IMC), edad, sexo y estado de diabetes tipo 2. El grupo de intervención realizó HIIT en un ergómetro durante 12 semanas mientras que el grupo de control mantuvo su estilo de vida sedentario. Durante este estudio, tres personas del grupo de control abandonaron debido a sospecha de enfermedad coronaria, falta de interés o miedo debido a la pandemia de Covid-19. En el grupo de intervención, un sujeto fue excluido después de finalizar el estudio debido al uso oculto de medicación inyectable para la diabetes, que fue un criterio de exclusión. En el grupo de control, tres sujetos usaron antibióticos durante la intervención y fueron excluidos del análisis metabolómico. En total, 42 sujetos finalizaron el estudio (Fig. 1) y se realizaron análisis metabolómicos en muestras de 39 sujetos. Debido a la pandemia de Covid-19, a partir de marzo de 2020 no se pudieron realizar biopsias de tejido adiposo en la semana 12 debido a la normativa nacional finlandesa. Por lo tanto, 19 muestras de biopsia de tejido adiposo desde el inicio y el final estuvieron disponibles y se analizaron más a fondo.

Diagrama de flujo del estudio, M hombre, F mujer.

Los resultados de los parámetros antropométricos y clínicos se muestran en la Tabla 1. Para los parámetros clínicos, se analizaron 22 sujetos en el grupo de control y 20 sujetos en el grupo de intervención. La edad media y el IMC en ambos grupos fueron similares (Tabla 1). Dos sujetos del grupo de control y tres del grupo de intervención tenían diabetes tipo 2. Los grupos no difirieron en el peso corporal, el IMC o la presión arterial al inicio o al final del estudio. La circunferencia de la cintura disminuyó significativamente en el grupo de intervención en comparación con el grupo de control después de 12 semanas (p = 0,028). El peso corporal se mantuvo estable en ambos grupos.

Se observó una disminución significativa en la concentración de glucosa plasmática en ayunas (p = 0,027) entre los grupos de control y de intervención a las 12 semanas (Tabla 1). Además, se midieron la concentración de glucosa y HbA1c mediante Freestyle libre durante 2 semanas antes del estudio y durante las dos últimas semanas. Cada sujeto midió los parámetros varias veces al día a través de un dispositivo. No se encontraron cambios significativos dentro o entre los grupos durante el estudio. El contenido hepático intrahepático no cambió significativamente al final del estudio (p = 0,698), así como las enzimas hepáticas ALT, AST y γ-GT en plasma en ayunas. Además, en plasma en ayunas, la fosfatasa alcalina, la albúmina y la bilirrubina no mostraron cambios (datos no mostrados). Además, no se observaron cambios significativos en los parámetros lipídicos en plasma en ayunas. El índice de esteatosis hepática (HSI) y el índice de hígado graso (FLI) tampoco cambiaron significativamente.

Los parámetros del ejercicio, la aptitud cardiorrespiratoria (tasa máxima de consumo de oxígeno (VO2max) y la carga de trabajo máxima alcanzada (maxW) se analizaron en 22 sujetos en el grupo de control y 19 sujetos en el grupo de intervención. Una persona en el grupo de ejercicio no participó. en la prueba final de ergoespirometría en la semana 12. Los niveles de condición física expresados ​​como VO2max y maxW mejoraron en el grupo HIIT y difirieron significativamente del grupo control (p < 0,001). No hubo cambios significativos en la concentración de un marcador de inflamación C-reactivo de alta sensibilidad. Se encontraron proteínas (hs-CRP).

La dieta habitual se mantuvo sin cambios durante la intervención y no hubo diferencias dentro o entre los grupos durante el estudio (Tabla complementaria 1). Además, no se observaron cambios en la composición corporal (Tabla complementaria 2).

El análisis LC-MS no dirigido de los perfiles metabólicos mostró diferencias entre las cuatro matrices de muestra diferentes: plasma, tejido adiposo (AT), orina y heces, como se visualiza mediante el análisis de componentes principales (Figura 1 complementaria). Las muestras de plasma y AT fueron más similares entre sí. La intervención HIIT provocó marcadas diferencias en los niveles de metabolitos en todas las matrices de muestra examinadas (Fig. 2). Sin embargo, la firma metabólica en cada uno de los tipos de muestra fue diferente, con composiciones variables de metabolitos que aumentaron o disminuyeron con la intervención HIIT. Como se detalla a continuación, las diferencias más notables se encontraron en los aminoácidos y sus derivados, los lípidos y los ácidos biliares.

Gráfico de volcán de metabolitos significativamente diferentes de la intervención de ejercicio en (a) tejido adiposo, (b) plasma, (c) orina, (d) heces. Los datos de todos los metabolitos se representan como estimaciones estandarizadas del modelo lineal mixto para la interacción entre el grupo (controles e intervención) y el tiempo (valor inicial y final de la intervención de ejercicio) versus el logaritmo negativo de los valores p brutos. Los umbrales se muestran como líneas discontinuas. Los metabolitos seleccionados como significativamente aumentados en el grupo de intervención se resaltan como puntos verdes, y aquellos que disminuyeron significativamente en el grupo de intervención en comparación con los controles se muestran como puntos verdes.

Al comparar el efecto de la intervención entre el grupo de intervención y el de control, el grupo más notable de compuestos diferenciales fueron los aminoácidos y sus derivados, incluidos los metabolitos de aminoácidos y dipéptidos y tripéptidos, como se visualiza en el gráfico del volcán y el análisis de la ruta ( Fig. 2 y Fig. 2 complementaria). La mayoría de estos compuestos aumentaron en particular en el AT y en el plasma en el grupo de intervención, mientras que disminuyeron en las muestras de orina y heces (Fig. 2, Tabla complementaria 3). En particular, los aminoácidos proteinogénicos (arginina, leucina, lisina, fenilalanina, metionina, tirosina, treonina y prolina) aumentaron en AT en el grupo de intervención. Además, otros derivados de estos aminoácidos, como el ácido leúcico (metabolito de leucina), la acetilisina, la dimetillisina, la prolina-hidroxiprolina y la dimetilarginina, también aumentaron de manera similar en el AT del grupo de intervención. El metabolito que más disminuyó en plasma después de la intervención de ejercicio fue la metilprolina, mientras que la dimetilarginina, los metabolitos del triptófano (ácido indoláctico y 3-(4-hidroxifenil)lactato), el derivado de alanina (sulfoxifenilacetil deshidroalanina), el metabolito de noradrenalina ((3-metoxi-4-hidroxifenilo) )sulfato de etilenglicol) y el ácido glutárico aumentaron en el plasma debido a la intervención HIIT. En las muestras de orina se encuentran aminoácidos como glutamina, ornitina y treonina; y los derivados como metilindol, metilcrotonilglicina, gamma-glutamilleucina, trimetillisina e isatina disminuyeron en el grupo de intervención. Además, un derivado de lisina (fructoselisina) y un derivado de metionina (adenosil-metionina) aumentaron en el grupo de intervención. En las muestras de heces, varios péptidos que contienen leucina (leucil-leucina, treonil-leucina, oleil-leucina, leucil-fenilalanina) y otros derivados de glicina e histidina como glicociamina, glicina-betaína y metilhistidina disminuyeron en el grupo de intervención, mientras que los xanturénicos El ácido, un metabolito en la vía de la quinurenina del metabolismo del triptófano, aumentó. De acuerdo con estos hallazgos, cuando los datos se analizaron utilizando MetaboAnalyst18, varias vías de metabolismo de aminoácidos en AT, orina y heces cambiaron notablemente (Figura 2 complementaria).

Los metabolitos diferenciales también se correlacionaron con varios parámetros clínicos para examinar más a fondo su relevancia para la NAFLD y el ejercicio. Los cambios de los parámetros clínicos mejorados, incluida la concentración de glucosa plasmática en ayunas, el VO2máx y la circunferencia de la cintura, se correlacionaron en su mayoría de manera positiva con los aminoácidos en AT en el grupo de intervención (Fig. 3). En el grupo de intervención, la circunferencia de la cintura se correlacionó positivamente con la leucil-leucina en AT; dimetilarginina, metilprolina y prolina hidroxiprolina en plasma; y se correlacionó negativamente con el ácido xanturénico en las heces. La concentración de glucosa en plasma se correlacionó positivamente con la treonina en plasma; prolina, ácido leúcico y ácido isopropilmálico en orina; y leucina en las heces. Correlaciones negativas significativas de trimetillisina en plasma; y también se observaron ácido glutárico y metionina en heces con circunferencia de cintura. El VO2máx se correlacionó significativamente de forma positiva con la leucil-leucina, la leucilfenilalanina y la metionina en AT; y glutamina e isatina en las heces. Prolina en plasma; y el ácido glutárico y la fenilalanina en las heces se correlacionaron positivamente con maxW. En AT, si bien se observaron fuertes correlaciones positivas de la mayoría de los aminoácidos y derivados con los parámetros hepáticos (Fig. 3), solo la prolina, la metilprolina, la sulfoxifenilacetil deshidroalanina y la isatina se correlacionaron significativamente con los parámetros lipídicos (Fig. 3 y Fig. Suplementaria). 3).

Mapa de calor que representa las correlaciones significativas de Spearman (ajustadas por edad, sexo, IMC y diabetes tipo 2) entre los parámetros clínicos (por columnas) y los principales metabolitos significativamente diferentes identificados en todas las matrices de muestra combinadas (por filas) utilizando el cambio delta desde el inicio hasta post intervención. El color de las celdas indica la fuerza de la relación (rs). Las celdas marcadas con asteriscos (*) demuestran correlaciones significativas (p < 0,05). Las barras laterales verdes indican el grupo de control y las barras laterales rojas representan el grupo de intervención con ejercicio. Cintura cm circunferencia de la cintura, DIH contenido de lípidos intrahepáticos, ALT alanina aminotransferasa, AST aspartato transaminasa, gGT gamma-glutamil transferasa, VO2max la tasa máxima de consumo de oxígeno (aptitud cardiorrespiratoria), maxW carga de trabajo máxima alcanzada, TC colesterol total, HDL lipoproteína de alta densidad colesterol.

El ejercicio también indujo cambios en varios lípidos y sus compuestos derivados, incluidos esfingolípidos, ácidos biliares, glicerofosfolípidos, acilcarnitinas y esteroles en las cuatro matrices de muestra diferentes. Además, el análisis de la vía también reveló marcadas diferencias en las vías del metabolismo de los lípidos en el plasma (Figura complementaria 2). Como se visualiza en el gráfico del volcán (Fig. 2), en plasma, seis esfingomielinas (SM) [SM d31:1, SM d32:1, SM d34:2, SM d35:2, SM d36:2, SM d(18 :2/15:0)] y una ceramida (Cer d32:1) aumentaron en el grupo de intervención. En el grupo de intervención, estos SM se correlacionaron positivamente con la circunferencia de la cintura, la concentración de glucosa en plasma, el VO2máx y la Wmáx en plasma (Fig. 3). Correlaciones positivas significativas de SM d32:1 con la circunferencia de la cintura; y se observaron SM d34:2 con VO2max y maxW. En la AT y la orina, se encontró que los ácidos biliares estaban disminuidos. Por ejemplo, los ácidos biliares glicoconjugados como el ácido glicoursodesoxicólico y el ácido glicodesoxicólico disminuyeron en AT; El ácido glicoursodesoxicólico y el ácido muricólico disminuyeron en la orina. Estos ácidos biliares se correlacionaron negativamente con la circunferencia de la cintura, la glucosa, el VO2máx y el Wmáx en AT, mientras que se correlacionaron positivamente en el plasma (Fig. 3).

Además, en el grupo de intervención, se encontró un aumento de varios glicerofosfolípidos en AT y plasma y una disminución en las heces (Fig. 2, Tabla complementaria 3). En particular, LPE 18:0 y LPE 16:0 aumentaron en AT. Además, LPE 16:0, PC 38:6, PC 32:0 y LPA 13:0 aumentaron en plasma. Una correlación positiva significativa de PC 38:6 con la circunferencia de la cintura; correlación negativa de LPC 18:1 con ALT; y se observó correlación negativa de LPA 13:0 con AST. LPC 18:1, LPE 18:0 y LPE 18:1 disminuyeron en el grupo de intervención en muestras de heces. Aquí, LPE 18:0 se correlacionó negativamente con ALT en el grupo de intervención.

En el grupo de intervención, los esteroles como el estigmasterol aumentaron en la AT y las heces. Además, los ácidos grasos también aumentaron en AT, plasma y orina. Por ejemplo, el ácido 12-hidroxidodecanoico (ácido graso de cadena media) aumentó en AT, el ácido 2-hidroxiesteárico (ácido graso de cadena larga) aumentó en plasma, y ​​el ácido docosahexaenoico (ácido graso de cadena muy larga) y el ácido petroselínico (ácido graso de cadena larga) aumentaron en plasma. ácido graso) aumentado en la orina. Además, las acilcarnitinas (propionilcarnitina y octadecanoilcarnitina), que también son ácidos grasos unidos a la carnitina, disminuyeron en la orina y las heces, respectivamente, en el grupo de intervención. En el grupo de intervención, el estigmasterol en las heces se correlacionó negativamente con TG y ApoB. En AT, el estigmasterol se correlacionó negativamente con las concentraciones de CT y LDL-C (Figura complementaria 3). El ácido docosahexaenoico en la orina se correlacionó positivamente con ApoA1, ApoB y TC en el grupo de intervención (Fig. 3 y Fig. 3 complementaria). La octadecanoilcarnitina en orina se correlacionó positivamente con las concentraciones plasmáticas de insulina y negativamente con la concentración de LDL-C en las heces en el grupo de intervención (Figura complementaria 3).

Además, los parámetros clínicos significativamente mejorados, incluida la circunferencia de la cintura, el VO2máx y la concentración de glucosa en ayunas, se correlacionaron con muchos metabolitos en el grupo de intervención (Fig. 3). Estos incluyeron correlaciones negativas de la circunferencia de la cintura y la concentración de glucosa con los lípidos (incluidos los ácidos biliares) en AT; pero correlaciones positivas con la circunferencia de la cintura y las concentraciones de glucosa en plasma. Además, las esfingomielinas se correlacionaron positivamente con la circunferencia de la cintura, VO2max y maxW en plasma.

El ejercicio físico ofrece beneficios para los pacientes con EHGNA19. Sin embargo, los mecanismos subyacentes mediante los cuales el ejercicio modula estos efectos siguen siendo poco conocidos. En este estudio, se empleó un enfoque de metabolómica no dirigida para dilucidar estos mecanismos mediante la identificación de cambios metabólicos asociados con NAFLD y sus parámetros clínicos relacionados tras una intervención de ejercicio.

La intervención con ejercicio fue exitosa y resultó en una disminución significativa en la concentración de glucosa plasmática y WC y un aumento en los parámetros de ejercicio (VO2max y maxW) sin pérdida de peso ni cambios en la dieta. La tasa de abandono de todo el estudio fue baja y 18 de 19 sujetos terminaron más de 20 de las 24 sesiones de ejercicio supervisadas. Los parámetros de ejercicio VO2max y maxW aumentaron significativamente en comparación con el grupo de control al final de la intervención. En línea con nuestro estudio, varios otros estudios sobre ejercicio han demostrado que los niveles de condición física aumentan con el entrenamiento continuo independientemente del régimen de ejercicio20,21,22. Además, se sabe que los niveles elevados de VO2máx confieren protección contra la hiperglucemia y la mortalidad por enfermedades cardiovasculares23,24. La tasa de abandono de todo el estudio fue baja y 18 de 19 sujetos terminaron más de 20 de las 24 sesiones de ejercicio supervisadas. El alto cumplimiento podría explicarse por planes de entrenamiento individuales bien diseñados basados ​​en la condición física del sujeto al inicio del estudio.

La concentración de glucosa plasmática en ayunas disminuyó significativamente, mientras que la concentración de insulina y HOMA IR (datos no mostrados) no disminuyeron significativamente en el grupo de intervención en comparación con el grupo de control. La mejora de la homeostasis de la glucosa después del ejercicio puede explicarse en parte por una mayor absorción de glucosa en los músculos esqueléticos a través de la proteína transportadora GLUT4, lo que conduce a una disminución de la concentración plasmática de glucosa25. Un resultado no significativo en la concentración de insulina puede explicarse tanto por la alta variabilidad como por la ausencia prevista de pérdida de peso. La CC disminuyó en el grupo de ejercicio después de la intervención en comparación con el grupo de control. La CC es un indicador esencial de obesidad central y resistencia a la insulina, y está fuertemente asociada con la mortalidad cardiovascular pero también con la mortalidad por todas las causas26,27. Una disminución de la CC puede reducir estos riesgos y el riesgo de desarrollar diabetes tipo 228. Sin embargo, la grasa del hígado no disminuyó significativamente durante la intervención en comparación con el grupo de control. Otras intervenciones de ejercicio han dado como resultado una reducción de la grasa hepática sin pérdida de peso29,30. Una posible explicación es que la adiposidad hepática no era alta en los sujetos que participaron en este estudio. Aunque tenían diagnóstico de NAFLD, algunos de ellos estaban en buen control y es por eso que su adiposidad hepática estaba dentro del rango normal. Otra explicación podría ser el número de sesiones de ejercicio por semana. Mientras que Winn et al. y Johnson et al. Realizamos cuatro y tres sesiones HIIT supervisadas por semana29,30 respectivamente, tuvimos dos sesiones supervisadas por semana, lo que podría no ser suficiente para mostrar resultados significativos con este número de sujetos. Además, no se observó ninguna mejora en el perfil de lípidos plasmáticos. Probablemente esto se deba a la falta de modificación dietética. Una dieta finlandesa común es rica en grasas saturadas31 y se instruyó a los sujetos a mantener sus hábitos alimentarios sin cambios durante el estudio.

Nuestra investigación metabolómica combinada con el análisis de la ruta de los metabolitos identificados mostró cambios significativos, especialmente en los aminoácidos y sus derivados después de la intervención de ejercicio (Fig. 2, Fig. 2 complementaria, Tabla complementaria 3). En el grupo de intervención se observó una acumulación de aminoácidos en AT. Particularmente interesante fue el aumento de leucina, aminoácido de cadena ramificada (BCAA). En personas obesas y resistentes a la insulina, se sabe que los BCAA tienen niveles reducidos de AT y concentraciones elevadas en plasma32,33. Esto provoca una descomposición masiva de estos aminoácidos en el músculo esquelético y el hígado, e induce resistencia a la insulina, provocando así la progresión de NAFLD. Sin embargo, la observación de BCAA acumulados en AT en el grupo de intervención podría implicar la mejora del potencial oxidativo mitocondrial de los BCAA durante el ejercicio, lo que podría aliviar o eliminar la acumulación de intermediarios catabólicos tóxicos de los BCAA que inducen resistencia a la insulina32. Otros efectos beneficiosos del aumento de BCAA en los adipocitos, especialmente la leucina, podrían estar mediados por la activación del objetivo mecanicista de la rapamicina (mTOR), lo que resulta en morfogénesis AT, diferenciación de los adipocitos, crecimiento hiperplásico, secreción de leptina en los adipocitos y termogénesis34,35. ,36. Además, los BCAA desempeñan en parte un papel en la biogénesis mitocondrial en las células del músculo esquelético y los adipocitos, lo que modula el metabolismo de los lípidos como inhibición de la síntesis de grasas y aumento de la oxidación de los ácidos grasos37,38,39. La leucina también puede promover el oscurecimiento de la AT a través de esta vía, pero los resultados son contradictorios y se justifican más estudios40.

Además de los BCAA, otros aminoácidos como la metionina, la treonina y la tirosina aumentaron en la AT en el grupo de intervención. Estos aminoácidos también podrían contribuir a mejorar el metabolismo de los lípidos y la glucosa mediante la activación de la cascada de señalización PGC-1α1-PPARα/ɣ. Como ejemplo, la suplementación dietética de treonina mejora el metabolismo de los lípidos en ratones obesos mediante la cascada de señalización de PPAR-γ junto con la regulación negativa de los niveles de expresión de la lipogénesis y la regulación positiva de los niveles de expresión de la lipólisis41. El ejercicio físico también favorece la activación del eje PPAR-γ/PGC-1α. Esto provoca la liberación de irisina, lo que promueve el oscurecimiento de las células grasas de color beige en el tejido adiposo blanco, una mayor termogénesis, un mayor gasto de energía y el mantenimiento de la homeostasis de la glucosa42,43. El aumento de los niveles de treonina in vivo en el grupo de intervención podría ser parcialmente responsable de estos efectos beneficiosos; sin embargo, se justifican más estudios44. De manera similar, el aumento de los niveles de tirosina observado en el análisis metabolómico y de vías (Fig. 2 y Fig. 2 complementaria) también podría contribuir a los beneficios relacionados con el ejercicio. La hidroxilación de la fenilalanina da como resultado la formación de tirosina. La tirosina podría entonces usarse como precursora de catecolaminas, que desempeña un papel vital en la mejora del rendimiento deportivo y regula la lipólisis en AT45,46. Por lo tanto, los niveles reducidos de fenilalanina en comparación con la tirosina podrían implicar una mayor producción de tirosina para cubrir la necesidad de catecolaminas durante el ejercicio47.

A diferencia de la acumulación de aminoácidos en AT, sus niveles en la orina disminuyeron durante la intervención. Los aminoácidos son generalmente más altos en las muestras de orina de pacientes con EHNA que en personas sin EHNA debido a anomalías en el metabolismo de los aminoácidos16. Una disminución de aminoácidos y sus derivados en la orina encontrada en este estudio podría implicar un menor daño hepático y una menor liberación de aminoácidos del hígado. La reducida presencia de péptidos en las heces podría implicar una mayor diversidad de la microbiota intestinal, asociada con el ejercicio y podría promover una mejor degradación de las proteínas48. Los ácidos grasos de cadena ramificada (BCFA) y los ácidos grasos de cadena corta (SCFA) producidos pueden modular el metabolismo de la glucosa y los lípidos49,50,51. Además, la propionilcarnitina aumentó en plasma. Es un AGCC esterificado en carnitina y se difunde a través de la membrana serosa hacia el sistema circulatorio para llegar principalmente a las células esqueléticas y cardíacas52,53. Por tanto, podría ser un marcador potencial para la producción de AGCC. Su biodisponibilidad es mejor que la carnitina y puede mejorar la disfunción cardiovascular y los trastornos metabólicos, incluida la resistencia a la insulina54.

El metabolito en plasma que disminuyó más significativamente después de la intervención de ejercicio fue el derivado AA metilprolina, que es un biomarcador de fibrosis55. Mardinoglu et al. informaron previamente una correlación de la metilprolina con la esteatosis hepática en las muestras de plasma. Además, los niveles plasmáticos de metilprolina cambiaron significativamente entre sujetos con esteatosis alta y baja56. Además, la metilprolina es un metabolito producido por la microbiota intestinal57. Por lo tanto, proponemos que el cambio inducido por el ejercicio en la composición o función microbiana intestinal podría aliviar la NAFLD al disminuir los niveles de este compuesto. Sin embargo, se justifican más estudios.

El cambio observado en varios metabolitos transmitidos por la microbiota intestinal, como el ácido indoláctico, indica que la composición o función de la microbiota intestinal se alteró debido a la intervención. El ácido indoláctico actúa como ligando para el receptor de aril hidrocarburo (AhR) y es expresado por células inmunes que regulan la homeostasis inmune intestinal58. La activación de AhR promueve la producción de interleucina-22, estimulando así la defensa de la mucosa mediante la inducción de proteínas antimicrobianas58. Además, la activación del AhR también disminuye los niveles de glucosa y triglicéridos en el suero de sujetos con obesidad y síndrome metabólico59. Por lo tanto, un aumento de ácido indoláctico en el plasma del grupo de intervención podría aliviar la NAFLD al mejorar la estimulación de la defensa de la mucosa, modular las respuestas inflamatorias y la homeostasis de la glucosa de una manera dependiente del AhR. Se han informado observaciones similares de aumento de los niveles de ácido indol láctico en muestras de plasma después de una prueba de ejercicio máximo en bicicleta60.

Las perturbaciones en el metabolismo de los lípidos contribuyen al desarrollo de NAFLD61. Especies específicas de estos lípidos, como los glicerofosfolípidos y los esfingolípidos, han estado implicadas en el estrés oxidativo, la resistencia a la insulina, la inflamación y la muerte celular61,62. Los SM son los esfingolípidos más abundantes y se sabe que regulan la homeostasis de la insulina y la glucosa63,64. En particular, se sabe que las especies de esfingolípidos de cadena muy larga (C < 22) protegen contra la intolerancia a la glucosa y el desarrollo de resistencia a la insulina hepática65. En este estudio, las SM de cadena muy larga, incluidas SM d31:1, SM d32:1, SM d34:2, SM d35:2, SM d36:2, SM d(18:2/15:0), aumentaron en plasma en el grupo de intervención, lo que destaca aún más el potencial de estos aumentos de SM en términos de mejora de la homeostasis de la insulina/glucosa. Sin embargo, debido a la diversidad de especies de SM, también se sabe que algunas son mediadoras de la resistencia a la insulina y podrían alterar la homeostasis de la glucosa63,64. Además, los niveles alterados de SM están implicados en el desarrollo y la gravedad de la NAFLD14,61,66; sin embargo, los resultados han sido inconsistentes. A modo de ejemplo, Draijer et al.67 han informado de un aumento de SM en muestras de plasma de niños obesos con esteatosis hepática. Por el contrario, Zhou et al. informaron niveles reducidos de SM en pacientes con EHNA en comparación con sus homólogos sin EHNA66. Además, los resultados de los estudios de intervención con ejercicios relacionados con los SM han sido inconsistentes. Si bien un estudio no encontró diferencias en los esfingolípidos séricos después del ejercicio64, otro estudio mostró concentraciones significativamente menores de ceramidas plasmáticas (C14:0, C16:0, C18:1 y C24:0) y una mejor sensibilidad a la insulina después del ejercicio68. Aunque esto podría explicarse por la diversidad de SM, se justifican más estudios para dilucidar el papel de los compuestos SM individuales en el ejercicio.

El ejercicio físico también modula el metabolismo de los lípidos al inducir alteraciones específicas de los tejidos69. Se han informado aumentos significativos de fosfatidiletanolaminas (PE) y una disminución significativa de fosfatidilcolinas (PC), liofosfatidilcolinas (LPC) y liofosfatidiletanolaminas (LPE) en niños obesos con esteatosis67. En este estudio observamos una acumulación de fosfolípidos en AT y plasma y su disminución en las heces en el grupo de intervención, que también fueron detallados. También observamos cambios marcados en el metabolismo de los glicerofosfolípidos en el análisis de la vía (Figura complementaria 2). Hoene et al.69 informaron observaciones similares de aumento de lisofosfolípidos hepáticos como resultado del ejercicio físico. Li y col. quienes realizaron un estudio de intervención similar al nuestro, encontraron que en las muestras de suero, los cambios en los contenidos de PE, fosfatidilinositol (PI) y ácido fosfatídico (PA) eran contrarios a nuestros resultados en plasma63. Esto podría deberse a que estas especies de lípidos son heterogéneas y pueden tener diferentes efectos relacionados con la composición de la cadena de acilo graso63.

Los ácidos biliares son actores esenciales del metabolismo humano implicados en el desarrollo y la progresión de NAFLD70. Anteriormente se han informado niveles elevados de ácidos biliares totales en suero, plasma, orina, hígado y heces en sujetos con NAFLD y NASH13,71,72,73. Sin embargo, existen incertidumbres con respecto a la naturaleza y la cantidad de cambios en los ácidos biliares en NAFLD74. Aunque no se ha estudiado exhaustivamente en sujetos con NAFLD, se ha informado que el ejercicio, en general, disminuye las concentraciones de ácidos biliares en la sangre y las heces75,76,77,78. Nuestro estudio observó una disminución de los ácidos biliares en la TA y la orina. En las muestras de plasma y heces, esta disminución fue nominal. Aunque la observación de una disminución de los ácidos biliares después de la intervención está en línea con estudios anteriores con una configuración similar75,76,77, es difícil sugerir por qué disminuyeron en todas las matrices de muestra en nuestro estudio actual. Los posibles mecanismos están relacionados con el hecho de que el ejercicio probablemente reduce la cantidad de lípidos y esto, a su vez, podría reducir la síntesis de ácidos biliares al tiempo que aumenta la eficiencia de la absorción de ácidos biliares. Esto podría provocar que se excreten menores cantidades de ácidos biliares en las heces78,79. Sin embargo, el nivel más bajo observado en AT y orina como se presenta aquí no se ha demostrado antes. Se necesitan más estudios para dilucidar los mecanismos en diferentes matrices de muestras.

Se sabe que los niveles elevados de ácidos biliares secundarios producidos por la microbiota intestinal contribuyen a la progresión de la EHNA70. Este estudio observó una disminución de los ácidos biliares secundarios como el ácido glicoursodesoxicólico y el ácido glicodesoxicólico. Morville et al.76 informaron observaciones similares de reducción del ácido glicodesoxicólico después del ejercicio de resistencia y de resistencia y de niveles reducidos de ácido glicodesoxicólico después del ejercicio de resistencia. Por lo tanto, el ejercicio probablemente altera la microbiota intestinal al disminuir las bacterias que metabolizan la glicina, reduciendo así los niveles de estos ácidos biliares glicoconjugados. Además, se informó una disminución de los niveles de glicina después de una serie de ejercicio en la orina y la sangre75. En nuestro estudio también se encontraron observaciones similares de niveles reducidos (pero no significativos) de glicina (Figura complementaria 4). Por lo tanto, la disponibilidad limitada de glicina para la conjugación de ácidos biliares también podría ser una razón para la disminución observada en los ácidos biliares glicoconjugados en este estudio.

Las concentraciones reducidas de carnitina, además de causar daño oxidativo celular, síntesis de ácidos grasos y trastornos del metabolismo energético, a menudo resultan en NAFLD16. Sin embargo, se sabe que el ejercicio acelera el metabolismo de las grasas, aumentando así los niveles de acilcarnitina en plasma69,80. Así, la disminución de estas acilcarnitinas en orina y heces en este estudio podría implicar que fueron utilizadas en circulación o como sustratos metabólicos para la actividad muscular81. Esto fue confirmado además por el aumento nominal de acilcarnitinas en plasma.

Curiosamente, el estigmasterol, un esterol de origen vegetal, aumentó en la AT y en las heces después del ejercicio. El estigmasterol está ampliamente presente en aceites vegetales y alimentos de origen vegetal y se sabe que tiene actividad antiosteoartrítica, antimutagénica, antiinflamatoria y antitumoral82,83,84,85. Dado que la dieta no cambió durante la intervención, estos cambios en el estigmasterol podrían ser el resultado de una mayor absorción después de la intervención con ejercicio.

En conjunto, en este estudio, el entrenamiento físico indujo mejoras en la circunferencia de la cintura, la concentración de glucosa en ayunas, el VO2max y el maxW. Los cambios en estos parámetros clínicos estuvieron fuertemente correlacionados con los cambios en los metabolitos durante el entrenamiento físico. Sin embargo, se necesitan más estudios para examinar la relevancia de estas correlaciones en el contexto de los efectos del ejercicio en la NAFLD. Además, los cambios en los metabolitos identificados durante la intervención se correlacionaron principalmente de manera significativa con los cambios en los parámetros hepáticos más que con los parámetros de lípidos y glucosa. Especialmente en AT, se observaron correlaciones positivas más fuertes de los aminoácidos y sus derivados con IHL, ALT, AST, γ-GT, particularmente en el grupo de intervención. Si bien la γ-GT estuvo elevada y empeoró de manera no significativa, todos los demás parámetros clínicos mejoraron nominalmente en el grupo de intervención después de 12 semanas. Sin embargo, sugiere que el metabolismo del tejido adiposo parece tener un papel esencial en la relación entre la homeostasis de la glucosa y el ejercicio sin pérdida de peso y podría desempeñar un papel crucial en la mejora de la NAFLD. Además, en el plasma, varios metabolitos, especialmente los SM que tienen un papel central en el metabolismo de la glucosa y los lípidos, se correlacionaron positivamente con un aumento significativo del VO2max y/o maxW. Las especies de esfingolípidos de cadena muy larga (C < 22) tienen efectos protectores contra la intolerancia a la glucosa y el desarrollo de resistencia hepática a la insulina65. Además, se ha informado que algunos esfingolípidos de cadena larga son marcadores útiles de la condición física y la respuesta al ejercicio en la enfermedad de las arterias coronarias86; sin embargo, no se comprende bien su papel en la NAFLD. Por lo tanto, la correlación positiva de los SM con los parámetros de condición física posiblemente podría indicar una mejora del metabolismo de la glucosa y los lípidos en la NAFLD con una mayor intensidad del ejercicio. Además, los metabolitos de los lípidos, incluidos los ácidos biliares, se alteraron independientemente de los marcadores clásicos del metabolismo de los lípidos, es decir, las concentraciones de LDL-C, HDL-C, triglicéridos y colesterol total. Esto posiblemente podría significar que la reducción del riesgo relativo de NAFLD y ECV con el entrenamiento físico no se limita a los marcadores clásicos de salud cardiometabólica. Esto podría respaldar aún más los posibles beneficios aditivos del ejercicio a diversas terapias farmacológicas.

Varios estudios han destacado que el ejercicio beneficia a los pacientes con NAFLD; sin embargo, los metabolitos, los mecanismos y las vías aún no se conocen bien. Hasta donde sabemos, este estudio fue el primero en estudiar los cambios metabólicos en sujetos con NAFLD debido al ejercicio físico en varias matrices de muestra. Además, proporcionamos una lectura metabólica completa en cuatro matrices de muestra diferentes y destacamos que el metabolismo alterado de aminoácidos y lípidos podría contribuir a los mecanismos subyacentes a los efectos beneficiosos del ejercicio en pacientes con NAFLD. En particular, como se ve en la Fig. 4, la mayoría de las alteraciones de los metabolitos fueron específicas del tipo de muestra, lo que resalta la importancia de la homeostasis metabólica de todo el cuerpo y la interacción con la microbiota intestinal, la circulación, la excreción y el metabolismo tisular, que no se pueden estudiar si se enfoca en especímenes de muestra única. Este estudio demostró que una intervención de ejercicio HIIT de 12 semanas tiene efectos beneficiosos de mejora en sujetos con NAFLD a nivel de todo el cuerpo, incluso sin cambios en la dieta. Incluso sin una pérdida de peso significativa, el HIIT disminuyó la concentración de glucosa en plasma y la circunferencia de la cintura, que es un indicador esencial de la obesidad central y se asocia con la resistencia a la insulina. Además, el HIIT aumentó los parámetros del ejercicio (VO2max y maxW), que se sabe que protegen contra la hiperglucemia. La disminución de la concentración de glucosa en plasma también estuvo implicada en el nivel de metabolitos, donde aumentó la concentración de SM en plasma, que participan en la regulación de la homeostasis de la glucosa. Las acumulaciones observadas de los aminoácidos en el plasma y AT; y la disminución de la excreción urinaria y fecal en el grupo de intervención podría indicar aún más su mejor utilización y metabolismo de la glucosa. Además, nuestro estudio proporcionó varios indicios de que el ejercicio media los beneficios metabólicos al inducir cambios en la composición o función microbiana intestinal, incluidos los SCFA y el ácido indol láctico, que participan en la regulación de los equilibrios de energía y glucosa.

Un entrenamiento en intervalos de alta intensidad de 12 semanas tiene efectos beneficiosos de mejora en sujetos con NAFLD a nivel de todo el cuerpo al regular el metabolismo de la glucosa y promover alteraciones en el metabolismo de aminoácidos, lípidos y ácidos biliares.

Aunque perfilamos una amplia gama de metabolitos en varias matrices de muestra en sujetos con NAFLD durante el ejercicio, una validación adicional en estudios más amplios fortalecería los resultados observados. Además, complementar este estudio con un análisis genómico y de expresión genética completo podría ayudar a explorar más a fondo los mecanismos detrás de la mejora de la NAFLD. Además, se podrían emplear modelos animales para examinar la relevancia de las correlaciones observadas en nuestro estudio. Además, el perfil metabólico del tejido muscular y hepático podría ayudar a avanzar aún más en nuestro conocimiento sobre la interferencia entre órganos inducida por el ejercicio en la NAFLD. Además, el análisis metabolómico aún está limitado debido a la disponibilidad incompleta de bibliotecas espectrales MS/MS para la anotación de todos los metabolitos importantes, lo que da como resultado un número relativamente grande de características que no se pudieron anotar, lo que justifica estudios futuros para investigar los cambios que ocurren en estos compuestos además de proporcionar confirmación a las identificaciones. Sin embargo, el estudio tuvo un número limitado de sujetos. Además, la prueba de tolerancia oral a la glucosa, que proporciona la respuesta del cuerpo a una carga de glucosa, no se pudo realizar debido a cuestiones prácticas relacionadas con el calendario muy estricto para los participantes. En general, nuestros resultados indican que la AT podría desempeñar un papel fundamental en la mejora de la concentración de glucosa en plasma y en la mediación de los beneficios relacionados con el ejercicio. Además, sin una pérdida de peso significativa ni cambios en la dieta, el ejercicio podría mejorar las condiciones de NAFLD al regular el metabolismo de la glucosa y promover alteraciones en el metabolismo de los aminoácidos, lípidos y ácidos biliares durante el ejercicio.

Este estudio fue un estudio de intervención con ejercicio controlado y aleatorizado. La aleatorización fue realizada por la enfermera del estudio basándose en una tabla de aleatorización emparejando a los sujetos según el IMC, la edad, el sexo y el estado de diabetes tipo 2 en dos grupos (Fig. 1). El grupo de intervención, el grupo de entrenamiento en intervalos de alta intensidad (grupo HIIT), siguió una intervención de ejercicio de 12 semanas que se prescribió individualmente según la prueba de ergoespirometría. El grupo control mantuvo su estilo de vida sedentario sin cambios en la actividad física. Los sujetos completaron tres visitas de estudio programadas al inicio, la semana 6 y la semana 12. El ensayo finalizó en junio de 2020.

El resultado primario fue el DIH y los resultados secundarios fueron las enzimas hepáticas, la glucosa y los parámetros lipídicos.

En total, se reclutaron 49 sujetos diagnosticados con NAFLD del Hospital Universitario de Kuopio (KUH), el Centro de Atención Médica de Kuopio y el Centro de Atención Médica Ocupacional. En total, 42 sujetos finalizaron el estudio (Fig. 1). El reclutamiento comenzó en abril de 2019 y finalizó en septiembre de 2019. La prueba finalizó en junio de 2020.

Los criterios de inclusión fueron edad de 18 a 70 años e IMC inferior a 35 kg/m2. El diagnóstico de NAFLD se basó en la ecografía del hígado, la resonancia magnética o la tomografía computarizada. Fueron elegibles los sujetos que usaban metformina, sulfonilureas, inhibidores del receptor SGLT2, estatinas y/o medicamentos para la presión arterial y sujetos con hipotiroidismo estable que tomaban medicamentos con tiroxina. Los principales criterios de exclusión incluyeron enfermedades agudas o evidencia actual de enfermedades inflamatorias o infecciosas agudas o crónicas. No se permiten sujetos con hepatitis B y/o C, hepatitis autoinmune, enfermedad de Wilson/deficiencia de alfa-1-antitripsina, hemocromatosis, hipotiroidismo inestable, lipoatrofia, trastorno hemorrágico, medicación anticoagulante o aquellos que no pueden o no desean someterse a una resonancia magnética (p. ej., claustrofobia, se incluyeron desfibrilador automático implantable, marcapasos). Además, se excluyó cualquier condición neurológica, musculoesquelética o cardiorrespiratoria que pusiera a los sujetos en riesgo durante el ejercicio o inhibiera su capacidad para adaptarse a un programa de ejercicio. Además, la participación en un programa regular de ejercicio y/o dieta dentro de los 3 meses anteriores al reclutamiento fue un criterio de exclusión. No se incluyeron sujetos con diagnóstico de diabetes tipo 1 o diabetes tipo 2 diagnosticada con insulina o tratamiento con agonistas de GLP-1. Además de eso, no se aceptaron sujetos diagnosticados con depresión o cualquier enfermedad mental que les impidiera comprender la naturaleza, el alcance o las posibles secuencias del estudio. El tabaquismo y el abuso de alcohol (consumo diario ≥ 30 g para hombres y ≥ 20 g para mujeres) también fueron criterios de exclusión.

Se instruyó a los sujetos para que mantuvieran sus hábitos dietéticos sin cambios. Mantuvieron un registro alimentario de 4 días justo antes del período de intervención y en la semana 11 durante la intervención. El registro de alimentos se mantuvo durante días consecutivos predefinidos (3 días laborables, 1 día de fin de semana) y lo revisó un nutricionista clínico al regresar. Se utilizó el software AivoDiet (versión 2.2.0.0, Aivo Finland Oy, Turku, Finlandia) para calcular la ingesta de nutrientes.

Para determinar la intensidad del programa de entrenamiento prescrito individualmente y la eficacia de la intervención de ejercicio, se realizaron pruebas de ergoespirometría en un cicloergómetro (Ergoline, Bitz, Alemania) al inicio y después de 12 semanas para los grupos de intervención y control. La prueba comenzó con un período de 1 minuto sentado en la silla, seguido de un calentamiento de 3 minutos con 0 Watts (W). Posteriormente, la carga de trabajo se incrementó gradualmente a intervalos de 6 s según un protocolo individualizado. La prueba fue supervisada por un médico y se animó verbalmente a los participantes a continuar hasta el agotamiento. El intercambio de gases respiratorios y la ventilación se midieron mediante el método respiración a respiración y se registró un electrocardiograma (ECG) durante toda la prueba de esfuerzo.

La intervención de ejercicio comenzó inmediatamente después de la prueba de ergoespirometría. El grupo de intervención siguió un protocolo HIIT en un cicloergómetro87. En detalle, el concepto de HIIT implicó series repetidas de ejercicio a una intensidad del 85% de maxW4 intercaladas por períodos de recuperación basados ​​en una prueba de ergoespirometría inicial (Tabla complementaria 4). maxW4 se refirió a la carga de trabajo hipotética sostenible durante 4 min88. Si bien es hipotético, maxW4 fue útil para definir la intensidad presumiblemente óptima para los intervalos de trabajo en HI. El grupo de intervención realizó sesiones HIIT que involucraron cinco series de intervalos de trabajo de 2 a 4 minutos (al 85% de maxW4) intercalados por 3 min de recuperación activa (al 20% de maxW4) dos veces por semana en días no consecutivos durante 12 semanas. Cada intervalo de trabajo duró 2 min durante la primera semana, con 5 s agregados por sesión de ejercicio (es decir, 10 s por semana), de modo que los intervalos HIIT duraron 4 min en la semana 12. Al comienzo del período de intervención, cada sesión HIIT duró aproximadamente 40 minutos, incluyendo el calentamiento (al 30% de maxW4), los períodos de recuperación y el enfriamiento (al 20% de maxW4). Al final del período de intervención, cada sesión de HIIT duró aproximadamente 50 min. El HIT se realizó en un grupo de 1 a 3 sujetos supervisados ​​estrechamente por un fisiólogo del ejercicio u otro profesional de la salud calificado (p. ej., un científico de laboratorio biomédico) adecuadamente capacitado para la tarea. Después del brote de Covid-19, el tamaño del grupo se redujo a 1 o 2 sujetos por cada sesión. Las primeras seis sesiones de entrenamiento de cada sujeto fueron seguidas bajo monitorización ECG.

Además, se prescribió un programa de entrenamiento individualizado para cada sujeto del grupo HIIT que consistía en ejercicio aeróbico de intensidad baja a moderada en el hogar. Un objetivo semanal general, incluido el ejercicio supervisado, era realizar 3 h de ejercicio aeróbico siguiendo las directrices internacionales89. El ejercicio en el hogar fue, por ejemplo, caminar, nadar y andar en bicicleta. El grupo de control recibió la atención habitual según la práctica médica regional para pacientes con NAFLD y se les indicó que mantuvieran su actividad física sin cambios durante el estudio.

La actividad física en el tiempo libre al inicio y durante el período de intervención se evaluó mediante el Cuestionario de Actividad Física en Tiempo Libre de Minnesota modificado90. Si bien el cuestionario original ha sido validado91, la versión modificada que se utilizará en el presente estudio no ha sido validada formalmente. Sin embargo, la viabilidad de la versión modificada ha sido confirmada en el estudio de intervención en el estilo de vida a gran escala de 4 años (DR's EXTRA)92. Todas las pruebas de ergoespirometría y sesiones HIIT se realizaron en el Instituto de Investigación de Medicina del Ejercicio de Kuopio.

El peso corporal se midió utilizando balanzas digitales. La circunferencia de la cintura se midió en el punto medio entre la ilíaca lateral y la costilla más baja con una precisión de 0,5 cm durante una exhalación utilizando una cinta métrica no estirable. La impedancia bioeléctrica determinó la composición corporal (analizador de composición corporal Inbody 720, EE. UU.) en posición de pie después de un ayuno de 12 h. Cada sujeto tuvo que beber 200 ml de agua tanto por la tarde como por la mañana antes de la medición. La presión arterial se midió dos veces con un monitor de presión arterial automático (Omron M 6 AC, Países Bajos). Los sujetos tuvieron un descanso de 15 minutos antes de la medición y hubo un descanso de 5 minutos entre las mediciones. Para el análisis de los datos se utilizó la media de las mediciones.

La calorimetría indirecta se realizó con un sistema analizador de gases de cubierta de flujo computarizado (Cosmed Quark, RMR, Italia) en ayunas al principio y al final del estudio (0 y 12 semanas). El gasto energético y las tasas de oxidación del sustrato se calcularon según Ferrannini93.

La monitorización de la glucosa (Freestyle Libre, EE. UU.) se realizó 2 semanas antes de que comenzara el ejercicio y en las semanas 11 + 12. Se indicó a los sujetos que realizaran entre 8 y 10 exploraciones por día. Después del período de seguimiento de 2 semanas, los resultados fueron procesados ​​por un software específico de Freestyle Libre para estimar la fluctuación diaria de la concentración de glucosa en sangre.

La grasa hepática se midió mediante resonancia magnética nuclear en el departamento de radiología del Hospital Universitario de Kuopio. Siemens Avanto_fit, NUMARIS/4; Se utilizaron máquinas Syngo MR E11 y Siemens Aera, NUMARIS/4 para realizar imágenes de secuencia axial fl2d6 2D para cubrir todo el hígado. Las imágenes se analizaron previamente para determinar sus aspectos clínicos en el hospital universitario de Kuopio y el análisis final se realizó en el Centro Médico de Ámsterdam mediante su algoritmo especial.

Se extrajeron muestras de sangre para determinar los parámetros clínicos en ayunas y se analizaron en la Business Enterprise Corporation del Centro de Laboratorios del Este de Finlandia (ISLAB, Hospital Universitario de Kuopio). La insulina, ApoA1 y ApoB se analizaron en la Universidad del Este de Finlandia (UEF).

El propio sujeto recogió muestras de heces en un recipiente de plástico con tapa mientras usaba guantes en las semanas 0, 6 y 12. El recipiente sellado se colocó en una hielera llena de bolsas de hielo y se llevó a la unidad de investigación al día siguiente. . Durante las semanas 6 y 12, se añadió una bolsa de papel para un generador anaeróbico. En la unidad de investigación, las muestras de heces se homogeneizaron directamente, se dividieron en alícuotas y se congelaron a -80 °C sin detergentes para su posterior análisis. Para el análisis se analizaron muestras de heces basales y de 12 semanas.

La orina se recogió durante 24 h en recipientes de plástico al inicio y al final del estudio para determinar el contenido de metabolitos. Las muestras fueron recolectadas por el propio sujeto, llevadas a la unidad de investigación y congeladas a -80 °C hasta el análisis.

Después de un ayuno nocturno y un reposo de 30 minutos, se tomaron muestras de tejido adiposo (TA) mediante biopsia abierta de TA abdominal subcutánea antes y después de la intervención bajo anestesia local y estéril (lidocaína 10 mg/mL). Las muestras de AT se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. Las muestras se almacenaron a -80 °C para su análisis.

La normalidad de los datos clínicos se determinó mediante un gráfico Q-Q. Las variables continuas se expresan como media y desviación estándar (DE) para medidas paramétricas. ALT, AST, insulina, TG y γ-GT se transformaron logarítmicamente. Las diferencias entre el grupo se analizaron con un modelo de regresión lineal, utilizando la edad, el sexo, el estado de diabetes tipo 2 y el IMC como covariables. Todos los análisis estadísticos descriptivos se realizaron utilizando el software estadístico SPSS (versiones 25 y 27, IBM Corp, Armonk, NY). Se estimó que habría una disminución del 2,38 % en el contenido de lípidos intrahepáticos (DIH), medido por MRS, en el grupo de intervención HIIT en comparación con el grupo de control. Para este tamaño del efecto se fijó un nivel de significancia de 0,05 y una potencia del 80%.

En este estudio se analizaron un total de cuatro tipos de muestras: plasma, AT, orina y heces. Todas las muestras se recodificaron y aleatorizaron utilizando Wranglr (https://github.com/antonvsdata/wranglr) y las muestras se prepararon según Klåvus et al.94. Brevemente, las muestras de plasma se prepararon añadiendo 400 µl de acetonitrilo frío a 100 µl de plasma, y ​​las muestras de orina se prepararon añadiendo 200 µl de acetonitrilo frío a 100 µl de la muestra de orina. Las muestras precipitadas se filtraron (placa de filtro Captiva ND de 0,2 µm) mediante centrifugación durante 5 minutos a 700 xga 4 °C. Las muestras filtradas se mantuvieron a 4 °C hasta su análisis. Las muestras de AT y heces se homogeneizaron añadiendo metanol acuoso de grado HPLC al 80 % v/v en una proporción de 500 µl por 100 mg de muestra para la extracción de metabolitos y la precipitación de proteínas utilizando el homogeneizador Bead Ruptor 24 Elite a una velocidad de 6 m/s a 0 ± 2 °C durante 30 s. Posteriormente, las muestras se agitaron y se centrifugaron durante 10 minutos a 4 °C y 20.000 xg. El sobrenadante se recogió y se filtró (placa de filtro Captiva ND de 0,2 µm) mediante centrifugación durante 5 minutos a 700 xga 4 °C en viales de HPLC y se mantuvo a 4 °C hasta el análisis. Se tomaron alícuotas de 2 µL de todos los tipos de muestras por separado, se mezclaron en un tubo (por tipo de muestra) y se utilizaron como muestras de control de calidad (para ese tipo de muestra) en el análisis.

El análisis del perfil metabólico no dirigido se realizó según lo descrito por Klåvus et al.94. Brevemente, se utilizó cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (sistema Vanquish Flex UHPLC, Thermo Scientific, Bremen, Alemania) acoplada a espectrometría de masas de alta resolución (Q Exactive Focus, Thermo Scientific, Bremen, Alemania). Aquí, cada muestra (1 µl por inyección) se analizó mediante cromatografía de fase reversa (RP) (Zorbax Eclipse XDBC18, 2,1 × 100 mm, 1,8 µm, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EE. UU.) mantenida a 40 °C. La fase móvil consistió en agua (solución A) y metanol (solución B), ambos conteniendo 0,1% v/v de ácido fórmico. El perfil del gradiente de elución fue el siguiente (t [min], %B): (0, 2), (10, 100), (14,5, 100), (14,51, 2), (16,5, 2). Los datos se adquirieron en modos de ionización por electropulverización tanto positivo (ESI+) como negativo (ESI-). Se inyectaron muestras de control de calidad al inicio del análisis y después de cada 12 muestras. Todos los datos se adquirieron en modo centroide utilizando FreeStyle 1.3 (Thermo Fisher Scientific).

Además, se utilizó 1290 Infinity Binary UPLC junto con un QTOF de masa precisa 6540 UHD (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) para LC-MS con cromatografía HILIC. Para la separación HILIC se utilizó una columna de amida Acquity UPLC BEH (2,1 x 100 mm, 1,7 μm; Waters Corporation) con un volumen de inyección de 3 μl. Las fases móviles eran 50 % de acetonitrilo (vol:vol; eluyente A) y 90 % de acetonitrilo (vol:vol; eluyente B), respectivamente, y ambas contenían 20 mmol/l de formiato de amonio, pH 3 (Sigma-Aldrich). El gradiente fue: 0–2,5 min, 100% B; 2,5 a 10 min, 100 % B → 0 % B; 10–10,1 min, 0 % B → 100 % B; 10,1 a 14 min, 100 % B y caudal de 0,6 ml/min. Después de cada separación cromatográfica, la ionización se llevó a cabo utilizando ionización por electropulverización (ESI) en chorro en modo positivo y negativo, produciendo cuatro archivos de datos por muestra. Las energías de colisión para el análisis MS/MS se eligieron como 10, 20 y 40 V por compatibilidad con las bases de datos espectrales. Se inyectaron muestras de control de calidad al inicio del análisis y después de cada 12 muestras. El software de adquisición de datos fue MassHunter Acquisition B.07.00 (Agilent Technologies). Además, se utilizó 1290 Infinity Binary UPLC junto con un QTOF de masa precisa 6540 UHD (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) para LC-MS con cromatografía HILIC. Para la separación HILIC se utilizó una columna de amida Acquity UPLC BEH (2,1 x 100 mm, 1,7 μm; Waters Corporation) con un volumen de inyección de 3 μl. Las fases móviles eran 50 % de acetonitrilo (vol:vol; eluyente A) y 90 % de acetonitrilo (vol:vol; eluyente B), respectivamente, y ambas contenían 20 mmol/l de formiato de amonio, pH 3 (Sigma-Aldrich). El gradiente fue: 0–2,5 min, 100% B; 2,5 a 10 min, 100 % B → 0 % B; 10–10,1 min, 0 % B → 100 % B; 10,1 a 14 min, 100 % B y caudal de 0,6 ml/min. Después de cada separación cromatográfica, la ionización se llevó a cabo utilizando ionización por electropulverización (ESI) en chorro en modo positivo y negativo, produciendo cuatro archivos de datos por muestra. Las energías de colisión para el análisis MS/MS se eligieron como 10, 20 y 40 V por compatibilidad con las bases de datos espectrales95,96,97. Se inyectaron muestras de control de calidad al inicio del análisis y después de cada 12 muestras. El software de adquisición de datos fue MassHunter Acquisition B.07.00 (Agilent Technologies).

Después de la conversión de los datos instrumentales sin procesar (archivos *.d) al formato ABF usando Reifycs Abf Converter (https://www.reifycs.com/AbfConverter), se empleó MS-DIAL (Versión 4.24)98 para la selección automatizada de picos y alineación. Los parámetros se establecieron según Klåvus et al.94. Después de la selección de picos, el resultado de la alineación en todos los tipos de muestras como áreas de picos se exportó a Microsoft Excel y en adelante se sometió a un preprocesamiento de datos. Se obtuvo un total de 134.313 características a partir de la selección de picos de los cuatro modos analíticos.

El preprocesamiento de datos se realizó por separado para cada matriz de muestra y modos analíticos utilizando R versión 3.6.199. Brevemente, se excluyeron las señales presentes en menos del 80% de las muestras en todos los grupos y con una tasa de detección inferior al 70% de las muestras de control de calidad agrupadas. Posteriormente, se corrigieron por desviación de intensidad94. Después de la corrección de la deriva, se eliminaron las muestras de control de calidad y se marcaron las señales de baja calidad de acuerdo con las directrices de Klåvus et al.94. Después de eso, los valores faltantes en las señales de alta calidad se imputaron mediante imputación forestal aleatoria. Los valores faltantes en señales de baja calidad se imputaron con ceros, ya que muchas de las señales de baja calidad mostraron una alta proporción de faltas, lo que impediría la imputación aleatoria de bosques.

Todos los análisis estadísticos de las señales de metabolitos se realizaron con R versión 3.6.199. Brevemente, se ajustó un modelo mixto lineal de características para detectar los metabolitos diferenciales utilizando los paquetes R lme4100 y lmer Test101. Los niveles de características se utilizaron como variables dependientes. Los efectos de la intervención, el tiempo y su interacción se modelaron como efectos fijos y la identificación del sujeto se utilizó como efecto aleatorio. El término de interacción refleja la diferencia en los cambios durante la intervención entre el grupo de control y el de intervención con ejercicio. La significancia de los coeficientes de regresión se probó utilizando la prueba con la aproximación de Satterthwaite para grados de libertad. Los intervalos de confianza se construyeron utilizando intervalos percentiles de arranque paramétrico con 1000 simulaciones. Se utilizó un valor p bruto <0,05 como criterio para una mayor investigación y anotación de señales. Además, también seleccionamos solo aquellas características que tenían un espectro MS/MS disponible y tenían un área de pico promedio de al menos 10 000 por tipo de muestra, incluidas en total 5067 características (469 plasma, 670 AT, 3020 orina y 1008 heces).

Las señales elegidas para una mayor investigación se anotaron utilizando MS-DIAL versión 4.2498 comparando la m/z exacta, el tiempo de retención y los patrones de fragmentación MS/MS con nuestra biblioteca estándar interna. Además, también se realizaron búsquedas adicionales en bases de datos espectrales de EM en línea95,96,102,103. Además, se utilizó MS-FINDER versión 3.50 para caracterizar las incógnitas104. Además, se utilizó el software del proveedor: Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.07.00 y FreeStyle 1.3 para la exploración de cromatogramas iónicos (EIC) extraídos de datos sin procesar y espectros de fragmentación MS/MS.

Después de la anotación, se realizó un análisis multivariado en R Versión 3.6.299. Se trazó un mapa de calor que representa las correlaciones de Spearman usando ClustVis105 individualmente para el cambio delta de las variables desde el inicio hasta después de la intervención para cada una de las matrices de muestra y se crearon gráficos de volcán de tamaño de efecto estandarizado y valores p de los modelos lineales mixtos usando VolcaNoseR106. Luego se analizaron y discutieron más detalladamente los 25 metabolitos más significativamente diferentes para cada matriz de muestra. Para los análisis de rutas, se utilizó MetaboAnalyst versión 5.0 con homo Sapiens KEGG como biblioteca de referencia y todos los compuestos en las rutas seleccionadas como metaboloma de referencia18. El análisis de sobrerrepresentación se realizó mediante la prueba exacta de Fisher y la topología de la ruta utilizando la centralidad de intermediación relativa.

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación del Distrito Hospitalario del Norte de Savo a partir del 1 de abril de 2019 (n.° de aprobación: 565/2019) y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes. El estudio que incluyó todos los métodos se realizó de acuerdo con la declaración de Helsinki y las directrices y regulaciones de la junta de revisión. El ensayo está registrado en ClinicalTrials.gov (NCT03995056, 10.06.2019).

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Los autores agradecen a las enfermeras Erja Kinnunen y Päivi Rytkönen por su ayuda en la realización del estudio y a la enfermera Päivi Turunen por su asistencia técnica en las biopsias de tejido adiposo. También agradecemos a los estudiantes de medicina Veera Peltokorpi, Mari Salo, Joona Joensuu y Ossi Surgeon por realizar la biopsia de tejido adiposo y a la Licenciada en Ciencias (nutrición) Janni Toropainen por analizar los registros alimentarios. Agradecemos al Prof. AJ Nederveen por analizar las imágenes de resonancia magnética en el Amsterdam Medical Center. La Figura 4 se realizó en parte utilizando BioRender (BioRender—biorender.com).

Este proyecto ha recibido financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención Marie Skłodowska-Curie nº 813781.

Estos autores contribuyeron igualmente: Ambrin Farizah Babu y Susanne Csader.

Departamento de Salud Pública y Nutrición Clínica, Universidad del Este de Finlandia, 70210, Kuopio, Finlandia

Ambrin Farizah Babu, Susanne Csader, Milla-Maria Tauriainen, Ville Koistinen, Kati Hanhineva y Ursula Schwab

Afekta Technologies Ltd., Yliopistonranta 1L, 70211, Kuopio, Finlandia

Ambrin Farizah Babu, Anton Klåvus, Ville Koistinen y Kati Hanhineva

Departamento de Medicina, Universidad del Este de Finlandia y Hospital Universitario de Kuopio, Kuopio, Finlandia

Ville Männistö y Milla-Maria Tauriainen

Instituto de Investigación de Medicina del Ejercicio de Kuopio, Kuopio, Finlandia

Heikki Pentikäinen y Kai Savonen

Departamento de Fisiología Clínica y Medicina Nuclear, Hospital Universitario de Kuopio, Kuopio, Finlandia

Kai Savonen

Departamento de Tecnologías de la Vida, Unidad de Química y Desarrollo de Alimentos, Universidad de Turku, 20014, Turku, Finlandia

Ville Koistinen y Kati Hanhineva

Departamento de Medicina, Endocrinología y Nutrición Clínica, Hospital Universitario de Kuopio, Kuopio, Finlandia

Úrsula Schwab

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US, VM y KS diseñaron el estudio. US, VM y MMT reclutaron a los sujetos. MMT realizó las biopsias de tejido adiposo. HP y KS supervisaron la intervención de ejercicio. SC y US realizaron el estudio de intervención incluyendo las estadísticas de los parámetros clínicos. AFB preparó muestras para el análisis metabolómico, analizó los datos metabolómicos y realizó análisis estadísticos para el análisis metabolómico y de correlación. AK realizó preprocesamiento de datos metabolómicos y análisis estadísticos. VK participó en la anotación de metabolitos. KH supervisó el análisis metabolómico. AFB y SC participaron en la redacción, revisión y edición del manuscrito. Todos los autores leyeron, revisaron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Ursula Schwab.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Babu, AF, Csader, S., Mannistö, V. et al. Efectos del ejercicio sobre NAFLD utilizando metabolómicas no dirigidas en tejido adiposo, plasma, orina y heces. Representante científico 12, 6485 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-10481-9

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Recibido: 29 de noviembre de 2021

Aceptado: 01 de abril de 2022

Publicado: 20 de abril de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-10481-9

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