Biodistribución y racemización del intestino.

Oct 12, 2023

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 851 (2023) Citar este artículo

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Los metabolitos derivados del microbioma son importantes para el eje microbioma-intestino-cerebro y el descubrimiento de nuevos tratamientos para enfermedades. La d-alanina (d-Ala) se encuentra en muchos animales como coagonista potencial de los receptores de N-metil-d-aspartato (NMDAR), receptores ampliamente utilizados en los sistemas nervioso y endocrino. El microbioma intestinal, la dieta y la supuesta síntesis endógena son fuentes potenciales de d-Ala en animales, aunque no hay evidencia directa que demuestre la distribución y racemización de la l-/d-Ala absorbida en el intestino con respecto a las interacciones huésped-microbio en animales. mamíferos. En este trabajo, utilizamos ratones libres de gérmenes para controlar la interferencia de la microbiota y l-/d-Ala marcados isotópicamente para rastrear su biodistribución y racemización in vivo. Los resultados mostraron una biodistribución dependiente del tiempo del d-Ala absorbido en el intestino, particularmente la acumulación de d-Ala absorbido en el intestino en los tejidos pancreáticos, el cerebro y la pituitaria. No se observó síntesis endógena de d-Ala mediante racemización en ratones libres de gérmenes. Se reveló que las fuentes de d-Ala en ratones eran la microbiota y la dieta, pero no la racemización endógena. Este trabajo indica la importancia de investigar más a fondo las funciones biológicas in vivo del d-Ala derivado del microbioma intestinal, particularmente en actividades relacionadas con NMDAR, para d-Ala como moléculas de señalización potenciales en el eje microbioma-intestino-cerebro.

La investigación de las interacciones químicas en el eje microbioma-intestino-cerebro se ha vuelto cada vez más importante para la comprensión y el tratamiento de enfermedades neurológicas como el trastorno del espectro autista1, la enfermedad de Alzheimer2 y la enfermedad de Parkinson3. Los metabolitos derivados del microbioma pueden participar en la señalización química entre células en diferentes tejidos y órganos del huésped, incluidos el sistema endocrino y nervioso central. El microbioma intestinal es conocido como fuente de una variedad de moléculas bioactivas como el N-óxido de trimetilamina relacionado con la salud cardiovascular4, metabolitos fenólicos que reducen la neurodegeneración5, ácidos grasos de cadena corta relacionados con enfermedades metabólicas6 y neurotransmisores como el ácido γ-aminobutírico. que pueden regular el sistema nervioso entérico7. Por lo tanto, el descubrimiento y la caracterización de metabolitos funcionales derivados del microbioma son importantes para futuras intervenciones en enfermedades basadas en el microbioma.

La d-alanina (d-Ala) es una molécula de señalización microbiana potencial mal caracterizada pero intrigante en el eje microbioma-intestino-cerebro. d-Ala es un componente esencial de las paredes celulares bacterianas, producido a partir de l-Ala por alanina racemasas microbianas y existe de forma casi ubicua en el ámbito de los microorganismos8. Al igual que la d-serina (d-Ser), la d-Ala interactúa con el sitio de unión de glicina de los receptores de N-metil-d-aspartato (NMDAR)9,10. NMDAR es un receptor ionotrópico de glutamato expresado en diferentes tipos de células, incluidas las neuronas, donde se asocia principalmente con sinapsis excitadoras11. d-Ser modula la actividad NMDAR en el sistema nervioso central, por lo que afecta las funciones cerebrales, lo que demuestra relevancia clínica para trastornos neurológicos como la depresión y la esquizofrenia12,13,14. De manera similar, se ha demostrado que d-Ala es un potente coagonista estéreoselectivo de NMDAR in vitro9,10. Utilizando Caenorhabditis elegans como modelo animal, los investigadores demostraron que d-Ala puede regular el comportamiento animal a través del NMDAR15. En animales superiores, aunque actualmente falta y se está investigando evidencia in vivo de la función d-Ala, la evidencia sugiere que d-Ala puede estar involucrado en una variedad de funciones, particularmente en los sistemas nervioso y endocrino. Por ejemplo, los niveles de d-Ala fluctúan de manera circadiana tanto en roedores como en tejidos humanos16,17,18,19. Al igual que con varios otros d-aminoácidos (d-AA), el d-Ala se detecta en estructuras endocrinas, incluidas las células β secretoras de insulina en los islotes pancreáticos y las células secretoras de hormona adrenocorticotrópica en la glándula pituitaria20,21,22,23. . Además, se encontraron niveles modificados de d-Ala en muestras de individuos con diversas enfermedades como la enfermedad de Alzheimer, diabetes, enfermedades renales, cánceres y más, como se resumió en nuestra revisión anterior24. Esto convierte a d-Ala en un biomarcador potencial y un objetivo farmacológico para estas enfermedades.

Sorprendentemente, dado este interés, se desconoce el origen del d-Ala en animales, particularmente en roedores ampliamente utilizados. Existen varias fuentes potenciales de d-Ala en los animales: dieta, microbiota intestinal y síntesis endógena. La dieta, especialmente los alimentos fermentados y procesados, contiene d-Ala y puede ser una fuente de d-Ala25. El origen microbiano del d-Ala está respaldado por varias pruebas. Nuestro trabajo demostró la producción de d-Ala por especies microbianas intestinales aisladas26. Otros grupos han demostrado la expresión de alanina racemasas en microorganismos27,28 y la dependencia de los niveles de d-Ala de la presencia de la microbiota intestinal18,29. Aunque no se han identificado racemasas de alanina endógenas en mamíferos, una hipótesis interesante se centra en la posible fuente de d-Ala en la saliva y las glándulas salivales30,31. Estos tres factores (dieta, microbiota intestinal y hipotética síntesis endógena) están entrelazados, lo que dificulta diferenciar los orígenes de d-Ala en tejidos y órganos animales.

En este estudio, utilizamos ratones libres de gérmenes (sin microbiota) y ratones criados convencionalmente (con microbiota normal), ambos alimentados por vía oral con d/l-Ala marcado isotópicamente estable. Los objetivos principales del estudio son (1) identificar los orígenes de d-Ala en ratones, (2) rastrear la biodistribución de d-Ala absorbida en el intestino y (3) proporcionar información sobre las funciones biológicas de d-Ala (Fig. 1 ). La utilización de ratones libres de gérmenes eliminó la microbiota como fuente de d-Ala, incluida la actividad bacteriana alanina racemasa relacionada. El Ala marcado con isótopos estables proporcionó evidencia directa de la absorción y biodistribución intestinal de d-Ala, así como de la ausencia de racemización endógena de l-Ala en nuestro marco de tiempo experimental. En los experimentos, las soluciones que contenían d- o l-Ala se administraron por vía oral mediante sonda forzada (exposición de 1 hora) o complementando el agua potable con estos isótopos durante dos semanas. Estos dos escenarios experimentales exploran la correlación de la biodistribución del metabolito con exposiciones a corto y largo plazo de animales a l/d-Ala exógeno. Para explorar la posible síntesis endógena de d-Ala mediante racemización, se alimentó a ratones convencionales y libres de gérmenes con isótopo estable marcado y se monitoreó el producto del isótopo d-Ala. Se utilizó la derivatización quiral de aminoácidos (AA) utilizando una versión modificada de los reactivos de Marfey para separar los enantiómeros d-/l-Ala extraídos de las muestras. Las concentraciones de Ala marcada con isótopos y sin marcar se midieron utilizando una cromatografía líquida de ultra rendimiento acoplada a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo. Por último, para proporcionar información inicial sobre el posible impacto biológico del d-Ala, los perfiles peptídicos en los islotes y la glándula pituitaria se caracterizaron mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo (TOF) de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI). Aquí confirmamos las fuentes de d-Ala en mamíferos y revelamos la biodistribución de d-Ala a través de la absorción intestinal, allanando el camino para futuros estudios funcionales de esta potencial molécula de señalización en el eje microbioma-intestino-cerebro.

El esquema experimental para la determinación de la biodistribución y racemización de l/d-alanina. Se ilustran dos escenarios de administración oral, alimentación forzada y suplementación con agua potable, seguidos de una tabla que describe las muestras recolectadas para el análisis de aminoácidos.

Se realizaron mediciones de d- y l-Ala libres endógenos y no marcados en las muestras de animales, así como en la comida para ratones (Fig. 2). Se calcularon los porcentajes de d-Ala (d-Ala/(l-Ala+d-Ala)%) para muestras de animales (Fig. 2a) y comida para ratones (Fig. 2b), y se representaron junto con las concentraciones de d-Ala (Fig. 2c-e). Para comparar el% de d-Ala y los niveles de d-Ala en cada tipo de muestra, se realizaron comparaciones por pares individualmente entre ratones convencionales y libres de gérmenes. Descubrimos que el plasma, la pituitaria, la glándula salival, el contenido del intestino delgado, el colon y el contenido del colon mostraron un mayor porcentaje de d-Ala en ratones convencionales en comparación con los ratones libres de gérmenes. Sin embargo, las tendencias de la concentración de d-Ala en las muestras no siempre fueron consistentes con el% de d-Ala. Sólo los tejidos acinares, el colon y el contenido intestinal mostraron concentraciones más altas de d-Ala. Entre todas las muestras, el contenido de colon de ratones convencionales mostró el mayor porcentaje de d-Ala. Los islotes pancreáticos y los tejidos acinares se encontraban entre los más altos en los tipos de tejido medidos tanto en ratones convencionales como libres de gérmenes. Mientras que los islotes y los tejidos acinares mostraron un% de d-Ala similar en ratones convencionales y libres de gérmenes, los tejidos acinares mostraron concentraciones más altas de d-Ala en ratones convencionales. Curiosamente, la concentración de d-Ala en ratones convencionales fue significativamente mayor que la de los ratones libres de gérmenes, mientras que el% de d-Ala fue similar, lo que indica una tendencia similar de l-Ala en los tejidos acinares de los ratones convencionales.

a Los porcentajes de d-Ala (d-Ala/(l-Ala+d-Ala)%) y (c – e) concentraciones de d-Ala se muestran en muestras de ratones libres de gérmenes (n = 8) y convencionales (n = 3), así como los porcentajes en pienso para ratones (b) (n = 4). Los asteriscos indican las comparaciones por pares con significación estadística (α = 0,05) de las pruebas de Mann-Whitney. Cada punto de datos representa una muestra de un animal individual; para la comida para ratones, cuatro puntos de datos representan cuatro muestras tomadas de dos lotes de alimento (1 y 3 muestras para cada lote). Las barras flotantes indican mínimo y máximo, y las líneas medias indican mediana. SI intestino delgado.

Se implementaron dos escenarios de administración oral de d-Ala-13C3,15N, una única alimentación forzada de ~40 mg con un tiempo de espera de 1 h y una alimentación de dos semanas de ~100 mg de d-Ala-13C3,15N, estimado mediante agua. consumo. Se midieron y calcularon los niveles de d-Ala-13C3,15N en varias muestras. La sangre de los tejidos se eliminó mediante perfusión transcardíaca en la recolección de tejidos. Las concentraciones de d-Ala-13C3,15N en el contenido de plasma/tejido/intestino se calcularon a partir del análisis de datos de LC-MS/MS, como se indica en la sección Método.

Primero descubrimos que la concentración plasmática de d-Ala-13C3,15N era drásticamente diferente en dos escenarios de administración oral (Fig. 3a, b). Por lo tanto, para permitir comparaciones entre los dos modelos de administración, normalizamos la concentración de d-Ala-13C3,15N en tejidos/contenido intestinal a la concentración de d-Ala-13C3,15N en el plasma del mismo animal (Ec. 1 en el Método ). Dicha estrategia de normalización fue respaldada por la observación visual y los resultados de correlación de Pearson que mostraron correlaciones en su mayoría positivas entre el nivel plasmático de d-Ala-13C3,15N y el nivel de d-Ala-13C3,15N en el tejido/intestino, lo que indica que el plasma d-Ala- El nivel de 13C3,15N se puede utilizar para representar el escenario de dosificación y normalizar las variaciones biológicas (Figura 1 complementaria, Tabla 1 complementaria). Se realizaron comparaciones por pares de la concentración normalizada de d-Ala-13C3, 15N entre alimentación forzada y alimentación del mismo tipo de muestra (Fig. 3c-e). Los resultados mostraron que las concentraciones normalizadas de d-Ala-13C3,15N en la hipófisis y el cerebro fueron estadísticamente significativamente mayores en el grupo de alimentación que en el grupo de alimentación forzada, mientras que, curiosamente, el contenido del intestino delgado mostró concentraciones normalizadas de d-Ala-13C3,15N más bajas en el grupo. grupo de alimentación. También comparamos los niveles relativos de d-Ala-13C3,15N entre tipos de muestras (Fig. 3f, g). La normalización de la concentración de d-Ala-13C3,15N a la concentración total de Ala sin marcar generó una métrica sin unidades para el nivel relativo de d-Ala-13C3,15N y permitió comparaciones entre muestras dentro del mismo escenario de administración (Ecuación 2). Se utilizó una prueba de Friedman pareada para hacer coincidir los tejidos del mismo animal en el análisis de varianza (ANOVA). Los resultados de ANOVA mostraron que el tipo de muestra tuvo un efecto estadísticamente significativo en el nivel relativo de d-Ala-13C3,15N tanto en el grupo de alimentación forzada (p = 0,0002) como en el de alimentación (p < 0,0001). En ambos modelos de administración, los tejidos de los islotes y acinares contribuyeron significativamente a las variaciones observadas y fueron estadísticamente significativamente más altos que otros tipos de muestras. Los niveles relativos de d-Ala-13C3, 15N en todos los tipos de muestras en el modelo de alimentación forzada son aproximadamente dos órdenes de magnitud más altos que los del modelo de alimentación, lo que coincide con la observación con plasma (Fig. 3a, b). También probamos otra estrategia de normalización normalizando aún más el nivel plasmático relativo de d-Ala-13C3,15N (Ec. 3) y encontramos resultados similares (Figura complementaria 2).

a, b Concentraciones (pmole/μL) de d-Ala-13C3,15N detectadas en plasma de animales a los que se les administró d-Ala-13C3,15N por vía oral mediante alimentación forzada o alimentación. c – e Concentraciones normalizadas de d-Ala-13C3,15N (Ec. 1) en varios tipos de muestras. Los asteriscos indican significancia estadística de las pruebas de Mann-Whitney. f, g Nivel relativo de d-Ala-13C3,15N (Ec. 2) en varios tipos de muestras en (f) experimentos de alimentación forzada y (g). Los asteriscos entre corchetes indican una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,05) entre los tipos de muestra de la comparación múltiple post hoc de Dunn después del ANOVA pareado de Friedman (**p < 0,01, *p < 0,05). Cada punto de datos representa una muestra de un animal individual (n = 4). Las barras flotantes indican mínimo y máximo, y las líneas medias indican mediana. Los resultados de las glándulas salivales en el experimento de alimentación forzada no se muestran en (b, c) y no se incluyen en las estadísticas debido al tamaño pequeño de las muestras (n = 2). N/S: no se muestra. SI: intestino delgado.

Se exploró el efecto de la administración de l- y d-Ala en ratones libres de gérmenes mediante el mapeo de los perfiles de péptidos biológicamente activos en los islotes pituitario y pancreático. El procedimiento de extracción de aminoácidos también extrajo péptidos de los mismos islotes pancreáticos y muestras de pituitaria. Utilizamos MALDI-TOF MS ya que solo requiere una pequeña porción de la cantidad limitada de muestra disponible; Pudimos detectar y semicuantificar múltiples péptidos biológicamente activos conocidos a partir de las mismas muestras que se utilizaron para el análisis de aminoácidos. Las listas de péptidos se construyeron haciendo coincidir las listas de masas adquiridas con la masa de péptidos predicha de UniProt y los resultados de estudios peptidómicos previos de los islotes pancreáticos y las hipófisis, incluidos datos de nuestro propio grupo32,33,34,35,36,37,38. Los péptidos detectados (Datos complementarios 1) se asignan a prohormonas conocidas que, según se informó, se expresaban en islotes o glándulas pituitarias, incluida la insulina 1, la cromogranina A, el polipéptido amiloide de los islotes, la somatostatina, el glucagón, la provasopresina y la proopiomelanocortina. Más importante aún, observamos múltiples péptidos de la misma prohormona mediante el método de huella digital de masa peptídica39,40, lo que aumentó la confianza tanto en la identificación de prohormonas como en la asignación de péptidos, como se demuestra en numerosos estudios38,41,42.

Los gráficos de volcanes en la Fig. 4 muestran las diferencias en los perfiles peptídicos de los islotes pancreáticos y la pituitaria después de la adición durante 2 semanas de un isótopo estable marcado como ly d-Ala al agua potable. Los límites para log2 (cambio en veces) se dibujaron en -1 y 1 y para los valores de p se colocaron en -log (0,05). Se utilizaron pruebas t individuales no apareadas y de dos colas para comparar la intensidad normalizada de las señales peptídicas en los grupos control y tratado. Se deben tener en cuenta los posibles descubrimientos falsos, ya que no se corrigió ninguna multiplicidad. En general, los l- y d-Ala marcados con isótopos estables dieron como resultado diferentes respuestas en los niveles de péptidos. Después del tratamiento con d-Ala-13C3, 15N, los islotes mostraron una disminución estadísticamente significativa del nivel de polipéptido amiloide de los islotes y un aumento del nivel de péptido C (Fig. 4a). No se encontraron cambios similares en los grupos de islotes pancreáticos tratados con l-Ala (Fig. 4b). En la pituitaria después del tratamiento con d-Ala-13C3,15N, el nivel del péptido intermedio similar a la corticotropina fosforilada mostró una disminución de más del doble, mientras que el péptido J mostró un aumento estadísticamente significativo (Fig. 4c). El tratamiento con l-Ala-2,3,3,3-D4 produjo más cambios en los niveles de péptidos en la pituitaria, pero fue bastante diferente de los grupos tratados con d-Ala-13C3,15N (Fig. 4d).

a, b Islotes pancreáticos. c, d Glándula pituitaria. Los gráficos de volcanes mostraron resultados de pruebas t múltiples no corregidas entre los grupos tratados y de control. Cada punto de datos representa el cambio en veces y los valores p de las intensidades máximas normalizadas y transformadas con log2 en las muestras de los animales tratados en comparación con el control. Los puntos de datos con un cambio absoluto superior a 2 veces y/o valores de p inferiores a 0,05 están marcados con nombres de péptidos asignados y codificados por colores (azul para disminución y rojo para aumento en el grupo tratado en comparación con el control). CLIP: péptido intermedio similar a la corticotropina. Péptido J: péptido de unión.

La actividad de la alanina racemasa se puede detectar monitoreando la conversión de l-Ala-2,3,3,3-d4 a d-Ala-3,3,3-d3 (Fig. 5a). Los niveles de d-Ala-3,3,3-d3 en diferentes muestras recolectadas de ratones libres de gérmenes, ratones convencionales y cultivos bacterianos después de la administración de l-Ala-2,3,3,3-d4 se determinaron a partir de señales de monitoreo en múltiples canales de monitoreo de reacción (MRM) para d-Ala-3,3,3-d3 y se muestran en la Fig. 5 después de los cálculos desde las señales sin procesar hasta las concentraciones finales. En todas las muestras de animales, observamos señales de fondo en los canales MRM para d-Ala-3,3,3-d3 que rodean el tiempo de retención de d-Ala (Figura complementaria 3 como ejemplo), que creemos que provienen del sistema biológico. matrices y, por lo tanto, dan como resultado los niveles de trazas de d-Ala-3,3,3-d3 que se muestran en las muestras de control (barras grises en la Fig. 5). Las comparaciones por pares entre los grupos control y tratado se realizaron mediante pruebas no paramétricas de Mann-Whitney. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas en los niveles de d-Ala-3,3,3-d3 entre los animales de control libres de gérmenes y los ratones alimentados con l-Ala-2,3,3,3-d4 durante 2 semanas, lo que indica que no hay actividades de alanina racemasa. detectado en ratones libres de gérmenes alimentados con l-Ala-2,3,3,3-d4 durante dos semanas consecutivas.

a Ilustración de la actividad de la alanina racemasa que convierte l-Ala-2,3,3,3-d4 en d-Ala-3,3,3-d3. b – e Concentraciones de d-Ala-3,3,3-d3 en muestras de ratones libres de gérmenes después de dos semanas de alimentación con l-Ala-2,3,3,3-d4 o agua normal como control. g – j Concentraciones de d-Ala-3,3,3-d3 en muestras de ratones convencionales 1 h después de la alimentación por sonda con una solución que contiene el mismo isótopo estable marcado como l-Ala o solución salina como control. Se realizaron comparaciones por pares utilizando pruebas de Mann-Whitney (de dos colas para ratones libres de gérmenes y de una cola para ratones convencionales) entre los grupos de control y dosificados individualmente para cada tipo de muestra. f Racemización de l-Ala-2,3,3,3-d4 en cultivo bacteriano. Se utilizaron pruebas de Mann-Whitney de una cola para comparar entre el tiempo cero y los otros dos puntos temporales individualmente. Cada punto de datos representa una muestra de un animal individual (n = 4 para ratones libres de gérmenes y n = 3 para ratones convencionales) o un tubo de biomasa bacteriana (n = 3). Los asteriscos entre paréntesis indican significancia estadística (U = 0, separación completa). Las barras flotantes indican mínimo y máximo, y las líneas medias indican mediana. SI: intestino delgado.

Para investigar la actividad de la alanina racemasa en cultivos puros de E. coli, se complementó l-Ala-2,3,3,3-d4 en los medios de cultivo y se determinaron las concentraciones de d-Ala-3,3,3-d3 en la biomasa bacteriana. Los resultados mostraron actividades de alanina racemasa en la biomasa de E. coli después de incubaciones de 1 h y 5 h, lo que condujo a un aumento dependiente del tiempo en los niveles del enantiómero d-Ala (Fig. 5f). Aunque los ratones libres de gérmenes no mostraron actividades detectables de alanina racemasa, la transformación de l-Ala-2,3,3,3-d4 en d-Ala-3,3,3-d3 se detectó fácilmente en ratones convencionales sólo 1- h después de la sonda oral de una dosis única alta de l-Ala-2,3,3,3-d4 (Fig. 5g-j). Los patrones de niveles relativos de d-Ala-3,3,3-d3 (Ec. 2) entre los tipos de muestras fueron similares a los de los experimentos de alimentación forzada de d-Ala-13C3,15N (Figura complementaria 4, Figura 3f). excepto en los dos puntos y el contenido de los dos puntos. A diferencia de los resultados de los experimentos de alimentación forzada con ratones libres de gérmenes, los niveles relativos de d-Ala-3,3,3-d3 en el colon y el contenido del colon fueron altos, lo que indica actividades racemasas microbianas en el contenido del colon.

Utilizando ratones libres de gérmenes y alanina marcada isotópicamente estable para administración oral, nuestros resultados arrojan varias conclusiones importantes. En primer lugar, el d-Ala libre en ratones se origina tanto en los alimentos como en la microbiota, pero no en la síntesis endógena. Los ratones libres de gérmenes tienen niveles detectables de d-Ala libre, lo que indica que existen fuentes de d-Ala que no están relacionadas con la microbiota (Fig. 2a). Como la comida para ratones tiene un alto% de d-Ala, la comida puede ser una fuente de d-Ala libre (Fig. 2b). Muchos estudios han demostrado que tanto los alimentos crudos como los procesados ​​contienen varios niveles de d-AA libres, incluido el d-Ala43. La comparación entre ratones convencionales y libres de gérmenes muestra claramente que la existencia de microbiota aumenta drásticamente los niveles de d-Ala en el contenido y el tejido del colon, lo que indica que el d-Ala derivado de la microbiota puede absorberse a través del colon (Fig. 2a, c, e ). El mayor nivel de d-Ala en el contenido del colon en comparación con el contenido del intestino delgado puede deberse a una mayor densidad de microbioma en el contenido del colon44. El % de d-Ala en el plasma, la hipófisis, las glándulas salivales y el contenido del intestino delgado es mayor en ratones convencionales en comparación con los de ratones libres de gérmenes, aunque las diferencias son menos obvias o desaparecen al observar las concentraciones de d-Ala (Fig. 2a). , C). Para el plasma, la pituitaria y el páncreas, no observamos diferencias drásticas en ratones libres de gérmenes en comparación con ratones libres de patógenos específicos, como informaron Karawaka et al.18. Esto podría deberse a razones que incluyen diferentes cepas de animales, alimento de elección, técnicas de medición del análisis de d-Ala, tipo de muestra (p. ej., páncreas completo versus tejidos acinares aislados), grado de extracción de sangre durante la preparación de la muestra, etc. Por ejemplo, Bruckner et al. determinaron el porcentaje de d-Ala en la comida para ratas hasta el 6,9%45, y medimos el 12,6% en la comida para ratones utilizada en nuestro estudio. Curiosamente, los niveles de d-Ala que medimos en este estudio parecen estar entre los más bajos informados, excepto en el contenido del colon (Tabla complementaria 2).

Nuestros resultados mostraron que no había actividad detectable de alanina racemasa en ratones libres de gérmenes. Se han encontrado alanina racemasas, que convierten l-Ala a su forma d, en muchos microbios y varios invertebrados acuáticos, pero no se ha caracterizado ninguna alanina racemasa en vertebrados8,24. La alineación multisecuencia de la serina racemasa de ratón y varias racemasas selectivas de aminoácidos de procariotas, levaduras e invertebrados mostraron más similitudes entre la serina racemasa de ratón y las racemasas de aminoácidos de amplia especificidad en comparación con las racemasas de alanina (Figura complementaria 5). Hasta ahora, la evidencia de actividad endógena de alanina racemasa en vertebrados está relacionada con la saliva y las glándulas salivales. Se ha informado que más del 30% del Ala total se encuentra en forma d en la saliva humana30,46. Sin embargo, los mismos estudios demostraron que el % de d-Ala era menor en las células del tejido bucal y en las glándulas salivales, mientras que los microorganismos de la cavidad bucal mostraban un porcentaje mayor de d-Ala. También se observaron niveles bajos de d-Ala en las glándulas salivales de rata (0,2-0,3%)31. Estos sugieren que el d-Ala que se origina en el microbioma oral probablemente contribuya al d-Ala detectado en la saliva. Sin embargo, no se puede descartar la hipótesis de la síntesis endógena de d-Ala. Nuestros resultados mostraron claramente que después de una administración oral de 2 semanas de l-Ala-2,3,3,3-d4, no se observó transformación de l a d-Ala (Fig. 5b-e). Para excluir el efecto de las impurezas enantioméricas en los estándares, se determinó que el nivel de d-Ala-3,3,3-d3 en la solución de l-Ala-2,3,3,3-d4 utilizada para la administración oral era insignificante ( ~0,1% después del autoclave) (Tabla complementaria 3). Concluimos que no hay actividades de alanina racemasa endógena presentes en ratones libres de gérmenes dentro del período de tiempo y la dosis de tratamiento que evaluamos. Como los microbios pueden transformar rápidamente l-Ala-2,3,3,3-d4 a su forma d (Fig. 5f), no fue sorprendente que un breve experimento de sondaje de l-Ala-2,3,3,3 -d4 realizado con ratones convencionales que poseen microbiota normal dio como resultado la detección de actividad de alanina racemasa en todos los tipos de muestras examinadas (Fig. 5g-j). De hecho, la comparación de la relación de isótopos d normalizada con Ala no marcada en todos los tipos de muestras mostró patrones muy similares a los observados en el experimento de alimentación forzada con d-Ala-13C3,15N (Fig. 4 complementaria; Fig. 3f), excepto por el colon y contenido de colon, donde se produjo d-Ala mediante actividades microbianas de alanina racemasa. Nuestros resultados respaldan firmemente la conclusión de que el d-Ala en ratón se originó a partir de la microbiota y los alimentos, y no por biosíntesis endógena mediante racemización enzimática.

Demostramos que el d-Ala puede ser absorbido por los intestinos y mostramos la biodistribución del d-Ala absorbido en el intestino mediante la administración oral de d-Ala-13C3,15N en ratones libres de gérmenes sin interferencia de la microbiota. Se ha realizado la administración oral de d-Ala en roedores47,48,49,50, mostrando niveles elevados de d-Ala en suero, orina y algunas partes del cerebro, pero no en la pituitaria. Sin embargo, la actividad alanina racemasa de la microbiota intestinal puede haber dificultado una evaluación precisa de la biodistribución de d-Ala absorbida en el intestino. Con ratones libres de gérmenes y d-Ala-13C3,15N, diferenciamos el d-Ala exógeno mediante administración oral y el d-Ala no marcado de los alimentos y excluimos la contribución de las actividades microbianas. Los dos escenarios de alimentación dieron como resultado una diferencia de ~400 veces en el nivel de d-Ala-13C3,15N en plasma, a pesar de que el consumo total de d-Ala-13C3,15N fue menor en el experimento a corto plazo (~40 vs ~ 100 mg) (Fig. 3a, b). Suponiendo una eficiencia de absorción de d-Ala similar a través del intestino, esto indicó que la mayor parte del d-Ala-13C3,15N administrado por vía oral probablemente se eliminó del animal con el tiempo. También determinamos que la sangre transportaba el d-Ala-13C3,15N absorbido por el intestino a los tejidos. En ambos escenarios de alimentación, la proporción de d-Ala-13C3,15N sobre la alanina total no marcada en plasma siempre estuvo entre las más altas en todas las muestras, excepto en los islotes y los tejidos acinares (Figura 1 complementaria), y en su mayoría se correlacionó positivamente con la proporción. en otras muestras (Tabla complementaria 1).

Obtuvimos evidencia clara de que el d-Ala absorbido por el intestino ingresa al sistema nervioso central y se acumula con el tiempo. La normalización de la concentración de d-Ala-13C3,15N (ecuaciones 1 a 3) permitió comparaciones entre escenarios de alimentación y entre tipos de muestras. Se encuentran niveles significativamente más altos de d-Ala-13C3,15N en la pituitaria (6 veces) y el cerebro (42 veces) del grupo de alimentación expuesto al isótopo durante 2 semanas en comparación con el grupo expuesto durante 1 hora de alimentación forzada. (Figura 3d). Estos hallazgos sugieren que el d-Ala-13C3,15N se acumuló en la pituitaria y el cerebro con el tiempo. La acumulación de d-Ala-13C3,15N en el cerebro también demuestra que d-Ala puede cruzar la barrera hematoencefálica. Como d-Ala es un coagonista de NMDAR y se ha descubierto que tiene diferentes concentraciones en diferentes partes del cerebro, la acumulación de d-Ala absorbida en el intestino en el cerebro a lo largo del tiempo sugiere un mecanismo para regular los niveles de d-Ala, que puede ser relacionados con sus funciones. Por ejemplo, se ha informado de la correlación de los niveles de d-Ala en roedores y humanos con el ritmo circadiano16,17,18,19, mientras que se informa que la concentración de d-Ala es alta en la glándula pineal49. Como tanto d-Ala como d-Ser interactúan con el mismo sitio de unión al receptor NMDA, será interesante determinar cómo interactúan estos dos sistemas, dado que uno es endógeno y el otro una molécula exógena.

Evidencia previa, incluida la inmunotinción contra d-Ala20,21 y la detección del cambio de d-Ala tras la estimulación con glucosa22, ha señalado la posibilidad de que d-Ala esté involucrado en la regulación del metabolismo de la glucosa y las funciones pituitarias. Curiosamente, los cambios circadianos de los niveles de d-Ala también parecen correlacionarse con los parámetros alimentarios y los niveles de insulina16 y la absorción intestinal diferencial de d-Ala18. Descubrimos que tanto en la administración oral a corto como a largo plazo de d-Ala-13C3,15N, la proporción normalizada de d-Ala-13C3,15N tanto en los islotes pancreáticos como en los tejidos acinares fue siempre similar y se encontraba entre las más altas medidas (Fig. .3f, g), a pesar de que la concentración normalizada de d-Ala-13C3,15N en los islotes pancreáticos fue mucho menor que la de los tejidos acinares (Fig. 3c). Los islotes y los tejidos acinares en animales no tratados también mostraron altos niveles de d-Ala% tanto en ratones convencionales como libres de gérmenes (Fig. 2a). En conjunto, estos hallazgos indican que los islotes y los tejidos acinares pueden absorber rápidamente d-Ala absorbido por el intestino y mantener un nivel relativamente estable de d-Ala con el tiempo.

Dados los altos niveles de d-Ala en estructuras endocrinas como los islotes y la pituitaria, nos preguntamos si la administración de d-Ala afecta las hormonas peptídicas. Investigaciones anteriores respaldan el impacto de la dinámica de los d-aminoácidos y los péptidos en los islotes pituitario y pancreático. Por ejemplo, se descubrió que el d-aspartato induce la liberación de prolactina, hormona del crecimiento y hormona luteinizante de la pituitaria anterior de la rata51,52. Por lo tanto, realizamos mediciones preliminares sobre los efectos de d-Ala en los islotes pituitario y pancreático recolectados de los mismos animales/muestras a las que se les administró d-Ala-13C3,15N o l-Ala-2,3,3,3-d4 durante 2 semanas (Fig. 4). Se utilizaron pruebas t múltiples, no corregidas y no apareadas, para maximizar el número de características moleculares que diferencian los perfiles peptídicos. Los resultados mostraron que el tratamiento de dos semanas con isótopos d-Ala o l-Ala produjo diferencias en los perfiles peptídicos de los islotes pancreáticos y de la glándula pituitaria. Se encontró que varios péptidos cambiaban los niveles sólo en los grupos tratados con d-Ala pero no en los grupos tratados con l-Ala. En la mayoría de los casos, sólo un péptido mostró un cambio notable en sus niveles en los grupos tratados, mientras que otros péptidos de la misma prohormona permanecieron iguales. Por ejemplo, de los péptidos detectados de la prohormona proopiomelanocortina, sólo el péptido intermedio fosforilado similar a la corticotropina que funciona como secretagogo de insulina en el páncreas53 y el péptido que se une con funciones biológicas desconocidas mostró cambios notables en sus niveles. Más interesante aún, las direcciones de cambio fueron opuestas para estos dos péptidos (Fig. 4c). La importancia biológica de estas observaciones requiere una mayor investigación con un método más cuantitativo para una comprensión más completa de la influencia de d-Ala en la dinámica de los péptidos.

En cuanto a su función, tanto d-Ser como d-Ala son coagonistas eficaces del receptor NMDA. Si bien d-Ser es un neuromodulador endógeno conocido, aquí demostramos que d-Ala no se sintetiza localmente sino que se deriva del microbioma intestinal y la dieta midiendo la acumulación y conversión de d-/l-Ala marcado isotópicamente estable después de la administración oral en germen. -ratones libres y convencionales. Descubrimos que los islotes pancreáticos y los tejidos acinares tenían los niveles más altos de isótopos de d-Ala absorbidos en el intestino, y los tejidos pituitario y cerebral acumularon d-Ala absorbido en el intestino con el tiempo. El perfil del cambio en el nivel de péptidos en la pituitaria y los islotes señaló la posible participación de L- y D-Ala absorbidos en el intestino en las funciones de los sistemas nervioso y endocrino. Concluimos que la microbiota y la dieta son dos fuentes de d-Ala en ratones, mientras que no se observó síntesis endógena de d-Ala mediante racemización endógena durante el período de nuestro diseño experimental. Nuestros resultados implican que la actividad del receptor NMDA depende de un equilibrio entre el d-Ser sintetizado endógenamente y el d-Ala exógeno derivado de la dieta/microbioma intestinal, lo que puede permitir una interacción metabólica única entre la microbiota, la dieta y los sistemas nervioso y endocrino para controlar Actividad del receptor NMDA.

Mientras tanto, varias limitaciones de este estudio plantean cuestiones que deberán abordarse en estudios posteriores. El uso de ratones libres de gérmenes plantea desafíos para comprender el papel de d-Ala en condiciones fisiológicas normales, ya que los ratones libres de gérmenes muestran anomalías bioquímicas y fisiológicas en comparación con los animales criados convencionalmente. Se necesita una mejor cuantificación de neuropéptidos y hormonas para una comprensión más completa del impacto de d-Ala en la dinámica de los péptidos, y se necesitan más detalles sobre los transportadores de d-Ala para comprender cómo varios sistemas nerviosos y endocrinos absorben d-Ala. Se utilizó el número limitado de animales y solo dos puntos de tiempo debido al gasto de las etiquetas isotópicas estables y los animales libres de gérmenes; sin embargo, un estudio a lo largo del tiempo podrá proporcionar más información sobre la farmacocinética del d-Ala absorbido en el intestino. Finalmente, con el descubrimiento de la acumulación de d-Ala en el cerebro, se necesitan más estudios para investigar la distribución del d-Ala absorbido en el intestino en diferentes regiones del cerebro.

Los isótopos d-Ala-13C3,15N (n.º de catálogo: 760277) y d-Ala-3,3,3-d3 (n.º de catálogo: 642975) se obtuvieron de Sigma Aldrich. l-Ala-3,3,3-d3 (n.º de cat.: DLM-248-1) y l-Ala-2,3,3,3-d4 (n.º de cat.: DLM-250-PK), l- Los isótopos Leu-5,5,5-d3 (n.º de cat.: DLM-1259) y l-Ser-13C,15N (n.º de cat.: CNLM-7814) se obtuvieron de Cambridge Isotope Laboratories. El l-Ala sin etiqueta se compró a Fluka y el d-Ala se compró a Sigma Aldrich. Se adquirió un juego de agujas de alimentación inoxidables reutilizables (N-PK) de 20 G y 1,5” de Braintree Scientific, Inc. Se compraron metanol (n.º de catálogo: A456) y H2O (n.º de catálogo: W64), grado Optima™ LC/MS. adquirido en Fisher Scientific.

Los experimentos con animales se realizaron siguiendo el protocolo de uso de animales n.º 19251 aprobado por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales (IACUC) de la Universidad de Illinois Urbana-Champaign (UIUC). Se obtuvieron ratones macho C57BL/6 libres de gérmenes (de 9 a 11 semanas de edad) del Rodent Gnotobiotic Facility de la UIUC. Se compraron ratones machos endogámicos C57BL/6 convencionales (8 semanas de edad) de Envigo y se alojaron en las instalaciones para animales del Instituto Beckman de la UIUC. Todos los ratones se alojaron en 2 animales por jaula. Tanto los ratones convencionales como los libres de gérmenes fueron alimentados con dieta para roedores extruida con proteína 2019S Teklad Global esterilizable al 19% (esterilizable) de Envigo. Como los machos y las hembras deben investigarse por separado debido a sus diferentes perfiles y ciclos hormonales, decidimos realizar este estudio únicamente con ratones macho.

Debido al alto precio de los ratones libres de gérmenes y los isótopos estables que utilizamos, decidimos utilizar el tamaño de muestra mínimo aceptable para las estadísticas (n = 3 o 4 para cada grupo) e investigar si se pueden observar efectos con un tamaño de muestra pequeño. Se eligieron aleatoriamente jaulas de ratones para realizar el control o la administración oral de isótopos estables. Cada experimento de administración oral consistió en un número igual de animales control y tratados (n = 2 para ratones libres de gérmenes, n = 3 para ratones convencionales). El experimento de administración oral a ratones libres de gérmenes se realizó dos veces en días diferentes y los resultados se combinaron para tener un tamaño de muestra total de 4.

Se prepararon soluciones de NaCl al 0,9% y 150 mg/ml de d-Ala-13C3,15N y se filtraron con un filtro estéril de PVDF de 0,22 μm. Con procedimientos estériles adecuados, se transfirieron a un gabinete de bioseguridad jaulas ventiladas individuales selladas con presión positiva que contenían ratones C57BL/6 libres de gérmenes de 10 semanas de edad, así como soluciones y herramientas. Todos los materiales se esterilizaron en autoclave/filtraron previamente y se desinfectaron inmediatamente antes de enviarlos al BSC a través de un portal específicamente diseñado. Cada ratón libre de gérmenes se pesó dentro de la cabina de bioseguridad y se les administró por vía oral 260–270 μL (10 ml/kg de masa corporal) de solución salina o solución de d-Ala-13C3,15N (1,5 g/kg de masa corporal) en la cabina de bioseguridad. gabinete, transferido de nuevo a su jaula original y enviado de nuevo al bastidor. Para minimizar el impacto del ritmo circadiano en los niveles de alanina en ratones, se realizaron experimentos de alimentación forzada aproximadamente a la misma hora todos los días (~11 a. m.). Después de 60 minutos, los ratones fueron enviados a eutanasia y disección con CO2. Cada experimento de alimentación forzada incluyó 4 ratones (2 para solución salina y 2 para d-Ala-13C3,15N). El experimento se repitió dos veces. Para los animales convencionales tratados con l-Ala-2,3,3,3-d4, los animales fueron alimentados con el mismo alimento que los ratones libres de gérmenes durante 2 semanas después de su llegada a nuestras instalaciones antes de los experimentos, y soluciones de NaCl al 0,9% y Se administraron por vía oral 150 mg/ml de l-Ala-2,3,3,3-d4 con 10 ml/kg de masa corporal de solución salina o l-Ala-2,3,3,3-d4 (1,5 g/kg de masa corporal). masa). El experimento de alimentación forzada incluyó a 6 ratones (3 para solución salina y 3 para l-Ala-2,3,3,3-d4) siguiendo el mismo cronograma que los experimentos libres de gérmenes.

Se prepararon soluciones de 1,25 g/l de d-Ala-13C3,15N y l-Ala-2,3,3,3-d4 usando la misma agua del grifo utilizada para alimentar a ratones libres de gérmenes, se esterilizaron en autoclave y se enviaron al BSC con la adecuada procedimientos estériles y se utiliza para llenar botellas de agua instaladas en jaulas de ratones. Dentro del BSC, se instalaron botellas de agua que contenían agua del grifo esterilizada, agua del grifo suplementada con d-Ala-13C3,15N o agua del grifo suplementada con l-Ala-2,3,3,3-d4 en jaulas que ya contenían 9– Se devolvieron los ratones de 10 semanas de edad y las jaulas al estante. Durante el tratamiento de dos semanas, los niveles de agua en la jaula de los ratones se controlaron visualmente cada dos días y se rellenaron cuando fue necesario. Cada experimento de alimentación incluyó 6 ratones (2 para cada condición) y el experimento se repitió dos veces.

Una vez finalizado el tiempo de tratamiento, los animales fueron transportados a una sala de procedimientos limpia o a una sala de necropsia alrededor del mediodía, sacrificados mediante asfixia con CO2 y seguido de una recolección de tejido durante las horas de la tarde. La sangre se extrajo usando una jeringa desechable de 1 ml directamente del corazón después de abrirla, se transfirió a un tubo BD Microtainer (n.º de catálogo 365965) y se depositó en hielo. El plasma se separó mediante centrifugación del tubo BD Microtainer (heparina de litio) a 3000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego, los animales se perfundieron con solución salina equilibrada de Gey modificada en frío (mGBSS, CaCl2 1,5 mM, KCl 4,9 mM, KH2PO4 0,2 mM, MgCl2 11 mM, MgSO4 0,3 mM, NaCl 138 mM, NaHCO3 27,7 mM, Na2HPO4 0,8 mM, HEPES 25 mM, pH 7,2) a través del corazón. Se perfundió páncreas de ratón con un pequeño volumen de solución digestiva fría (ver más abajo para más detalles) y se recogió para el aislamiento de islotes y tejidos acinares. Los tractos gastrointestinales, incluidos el intestino delgado y el colon, se abrieron longitudinalmente para recolectar el contenido del intestino delgado y el colon, y los tejidos del tracto gastrointestinal se enjuagaron varias veces en tampón PBS helado antes de la recolección. También se recogieron cerebro, glándulas salivales y glándulas pituitarias. Todos los tejidos y contenidos intestinales, así como el plasma separado, se colocaron en hielo seco inmediatamente después de la recolección y se almacenaron a -80 ° C hasta los siguientes pasos.

1,06 unidades Wünsch de Liberase TL (Sigma) y 0,1 mg/mL de DNasa I recombinante (desoxirribonucleasa) preparadas en solución tampón equilibrada de Hank (HBSS, GIBCO) con cloruro de calcio 5 mM y HEPES 25 mM (Sigma) y reposar en hielo hasta su uso. . Se perfundieron 2 ml de esta solución enzimática en el páncreas del ratón a través del conducto biliar común. El páncreas perfundido se extrajo del cuerpo y se colocó en tubos cónicos con 5 ml de solución Liberase fría sobre hielo. Los tubos se colocaron en un baño de agua precalentado a 37 °C durante 10 minutos para la digestión. Al final de la incubación, se añadió a los tubos HBSS frío con albúmina sérica bovina al 0,2% y los tubos se agitaron vigorosamente para garantizar que los islotes estuvieran completamente separados del tejido. Después de la centrifugación a 300 g durante 3 min, se eliminó el sobrenadante. Estos pasos se repitieron 3 veces. En el último paso, se decantó el sobrenadante y se eliminaron mecánicamente los restos del tampón dentro del tubo. Posteriormente, los sedimentos de tejido digerido se resuspendieron en 7 ml de solución estéril Histopaque 1077 (Sigma) con agitación suave. Se colocaron 3 ml de tampón HBSS frío sobre la suspensión de tejido y los tubos se centrifugaron a 900 g durante 15 minutos. Los islotes ubicados en los sobrenadantes se filtraron a través de un filtro celular estéril de 70 μm y se lavaron 3 veces usando HBSS frío para eliminar los restos celulares. Los islotes purificados se colocaron en una placa de Petri llena con HBSS frío, se recogieron manualmente rápidamente y se transfirieron al MeOH acidificado en frío para la extracción del analito (MeOH:H2O:ácido acético 90:9:1 en volumen).

La cepa OP50 de Escherichia coli (E. coli) se cultivó en placas de agar Luria-Bertani y se recogieron colonias individuales y se inocularon en una botella de 100 ml de caldo Luria-Bertani líquido para su crecimiento durante la noche. Al día siguiente, se transfirieron alícuotas de 5 ml de cultivo líquido de E. coli durante la noche a tubos de cultivo estériles y se transfirieron 1 ml de solución estéril de l-Ala-2,3,3,3-d4 a 1,25 g/l o agua tratada en autoclave. agregado. Se recogieron alícuotas de 1 ml de cultivo líquido bacteriano antes de agregar el isótopo y 1 y 5 h después de agregar el isótopo. La biomasa se recogió mediante centrifugación a 16.000 g durante 1 min, el sobrenadante se eliminó con una punta de pipeta de 1 ml, se centrifugó nuevamente, el sobrenadante restante se eliminó con una punta de pipeta de 200 μL, se centrifugó y el sobrenadante formado se eliminó usando una punta de pipeta de 10 μL. . La biomasa granulada resultante se pesó y se congeló a -80 °C hasta la extracción de aminoácidos.

Se trituraron muestras congeladas de cerebro, glándula salival, intestino delgado, colon o comida para ratones usando un pulverizador de tejido metálico o un martillo de metal sobre una superficie metálica plana, y todas las partes metálicas se mantuvieron frías en hielo seco en todo momento. Luego se transfirieron rápidamente los copos fríos triturados de las muestras a un tubo CKMix de homogeneización de tejidos de 2 ml. Después de pesar, se agregaron 600 μl de MeOH:H2O 1:1 helado para la homogeneización del tejido utilizando un homogeneizador de tejido Precellys® Evolution con una trampa fría (Bertin Corp.). Las muestras se homogeneizaron dos veces a 2 x 30 s con una pausa de 30 s a 7200 rpm dos veces, y las suspensiones resultantes se transfirieron y centrifugaron a 12 000 g durante 20 min a 4 °C. El sobrenadante se transfirió a otro tubo y se secó usando un concentrador centrífugo miVac Genevac™. Al sedimento restante se le agregaron 600 µl de agua helada, seguido de vórtex, sonicación y centrifugación a 12.000 g durante 20 minutos a 4 °C. Se recogió el sobrenadante acuoso, se añadió al tubo seco previamente utilizado para la recogida del sobrenadante de metanol y se secó utilizando el concentrador de vacío. Las muestras resultantes se almacenaron a -20 °C hasta los siguientes pasos.

Las muestras congeladas se descongelaron y se usaron espátulas desechables para recoger y transferir parte de la muestra a un tubo CKMix de homogeneización de tejidos. Se siguieron los mismos pasos de procesamiento de muestras y extracción de analitos que para las muestras de cerebro/glándulas salivales/intestino.

Se descongelaron muestras de plasma congeladas y se transfirieron 40 µL de plasma a un tubo nuevo. Se agregaron secuencialmente 600 μL de 1:1 MeOH:H2O y 600 μL de H2O para extraer muestras de plasma. Los sobrenadantes resultantes se combinaron, secaron y almacenaron usando el mismo procedimiento anterior.

Se utilizó un procedimiento que incluía agua hirviendo, MeOH acidificado y una solución de ácido acético al 0,25% para extraer aminoácidos y péptidos de muestras de glándula pituitaria. A las muestras de hipófisis congeladas, se les agregaron 400 μL de agua precalentada a 90 °C, seguido de una incubación de 10 minutos en un baño de agua hirviendo. Las muestras se enfriaron inmediatamente en hielo. Se utilizó un homogeneizador manual con un mortero de plástico desechable para romper y homogeneizar las muestras, seguido de una centrifugación a 12.000 g durante 15 minutos a 4 °C. Se recogieron los sobrenadantes, se transfirieron a tubos de recogida de baja unión a proteínas (Thermo Fisher) y se evaporaron hasta sequedad utilizando el concentrador Genevac. Se repitió el mismo procedimiento de extracción con 400 µl de MeOH acidificado y 400 µl de ácido acético al 0,25 %, excepto que se utilizó sonicación en baño en lugar de homogeneizador manual. Las muestras secas se almacenaron a -20 °C hasta su uso posterior.

Los islotes y los tejidos acinares almacenados en 400 μl de MeOH acidificado se homogeneizaron con un homogeneizador manual basado en un mortero de plástico desechable, seguido de una centrifugación a 15.000 g durante 15 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes se transfirieron a un nuevo tubo de baja unión a proteínas. Los gránulos restantes se extrajeron con 400 μl de MeOH y 400 μl de agua mediante sonicación en baño. Los tres sobrenadantes se combinaron, se mezclaron, se dividieron en alícuotas y se evaporaron hasta sequedad. Las muestras secas se almacenaron a -20 °C hasta su uso posterior.

Se procesaron extractos de cerebro, glándulas salivales, intestinos, contenido intestinal, plasma y muestras de alimento para ratones utilizando filtros centrífugos. Se usó 1-Leu-5,5,5-d3 como estándar interno para contar el rendimiento de recuperación en la filtración centrífuga. Los extractos secos se reconstituyeron en 300 μL de una solución de l-Leu-5,5,5-d3 33-100 μM en agua, seguido de agitación, sonicación y centrifugación a 16.000 g durante 15 minutos a 4 °C. Luego, los sobrenadantes se filtraron con dispositivos centrífugos Nanosep MF de 0,45 µm con membrana Bio-Inert® a 10.000 g durante 15 minutos a 4 °C, seguido de filtración mediante dispositivos centrífugos Nanosep® de 3 K con membrana Omega ™ a 10.000 g durante 65–75 mín. a 4ºC. Luego, los filtrados se secaron usando un concentrador Eppendorf Vacufuge y se almacenaron a -20 °C hasta los siguientes pasos.

La biomasa bacteriana congelada se descongeló y se agregaron 300 μl de MeOH a cada muestra. La biomasa se dispersó en MeOH mediante pipeteo repetido, seguido de sonicación en baño durante 10 minutos o hasta que estuviera visiblemente completamente dispersa. La suspensión resultante se centrifugó a 16.000 g durante 2 minutos y se recogió el sobrenadante. Los sedimentos restantes se extrajeron adicionalmente con 300 µl de agua y se recogió el sobrenadante. Los sobrenadantes de dos rondas de extracción de analitos para la misma muestra se combinaron y secaron usando un concentrador Eppendorf Vacufuge y se almacenaron a -20 °C hasta los siguientes pasos.

Se reconstituyeron muestras de pituitaria, islotes y tejido acinar en 40 µl de solución de ácido trifluoroacético al 0,1% en agua. Las muestras reconstituidas se centrifugaron a 12-14 000 g durante 15 minutos a 4 °C. Se mezclaron 0,5 µl de sobrenadantes con volúmenes iguales de solución de ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico en una placa de muestra y se secaron. Se tomó otra alícuota para el ensayo BCA y el resto de los extractos se secaron y almacenaron a -20 °C. El análisis MALDI-TOF MS se realizó utilizando un sistema ultrafleXtreme II (Bruker Daltonics, Billerica, MA) que funciona en modo positivo. Se examinó el rango de m/z 800–6000 en modo reflector. Los espectros de masas se analizaron utilizando el software flexAnalysis (Bruker). Los picos se seleccionaron automáticamente con el algoritmo de detección de picos Snap y un umbral de relación S/N de 6 o se seleccionaron manualmente cuando un pico observable coincide con un péptido previsto o informado. Cuando solo se observó ruido de fondo, no se eligió el pico y el punto de datos se marcó como en el nivel de fondo y, por lo tanto, no se utilizó para estadísticas. Las listas de péptidos identificados se construyeron haciendo coincidir las listas de masas adquiridas con la masa de péptidos predicha de UniProt y los resultados de estudios peptidómicos previos de los islotes pancreáticos y la hipófisis, incluidos datos de nuestro propio grupo32,33,34,35,36,37,38. Se puede encontrar una lista de péptidos identificados en los Datos complementarios 1. Las intensidades máximas de los aductos de sal ([M+Na]+, [M + K]+) se resumieron con la intensidad del ion molecular protonado [M + H]+ para representan la intensidad total del péptido en cada espectro. Luego, la intensidad sumada se normalizó a la corriente iónica total del espectro. Se utilizaron pruebas t múltiples sin corregir para determinar las diferencias en las intensidades máximas normalizadas de la corriente iónica total entre los grupos de control y tratados y los resultados se presentaron en forma de gráficos de volcán para mostrar los valores de cambio y la significación estadística.

El ensayo del contenido de proteína total de BCA se realizó en muestras de pituitaria, islotes y tejido acinar utilizando el ensayo de proteínas BCA Pierce™ (Thermo Fisher, n.º de catálogo: 23225) o el ensayo de proteínas Micro BCA™ (Thermo Fisher, n.º de catálogo: 23235). . Se tomó un volumen de muestra de 1 a 2 μl de muestras reconstituidas preparadas para el análisis MALDI-TOF MS y diluidas según el protocolo del fabricante. Se construyeron curvas de calibración de 0-40 μg/ml para los ensayos.

Se usó una variación del reactivo de Marfey, Nα-(2,4-dinitro-5-fluorofenil)-l-valinamida (FDVA, Cat. # 42102, Sigma), para reaccionar con aminas libres de analitos presentes en muestras para ayudar a la separación. de l/d-Ala mediante cromatografía líquida de fase inversa y cuantificación de analitos mediante espectrometría de masas54. En la figura complementaria 6 se muestra un esquema de reacción y un ejemplo de separación de 1/d-Ala. Se eligió la estrategia de derivatización debido a su mayor sensibilidad en comparación con la separación en columna quiral en alanina no derivatizada. Las muestras secas se reconstituyeron en 100 o 120 μl de solución NaHCO3 0,5 M (50 μl para muestras de pituitaria, 22 μl para muestras de islotes/acinares). Serie de estándares de l/d-Ala (4-800 μM para ly 0,1-40 μM para d), d-Ala-13C3,15N (10 μM-4 mM), l/d-Ala-3,3,3 -d3 (2-400 μM para ly 1-200 μM para d), y l-Ala-2,3,3,3-d4 (1-400 μM) y l-serina-13C,15N (4 mM , como estándar interno en inyección LC) también se prepararon en NaHCO3 0,5 M. Se pesó FDVA usando una balanza analítica y se disolvió en acetonitrilo hasta una concentración final de 5-6 mg/ml (1 mg/ml para muestras de islotes/acinares). Las muestras reconstituidas se centrifugaron a 16.000 g durante 5 min a 4 °C, y se mezclaron alícuotas de 10 µL de sobrenadantes o sobrenadantes diluidos en NaHCO3 0,5 M con 10 µL de solución de FDVA en tubos de PCR de 0,2 ml (excepto para muestras de 20 µL y 20 µL). Solución de FDVA para islotes y muestras de tejido acinar). Los estándares se mezclaron directamente 1:1 con solución de FDVA en los mismos volúmenes. Las mezclas se hicieron reaccionar a 60 °C durante 3 h en un ciclador térmico Bio-Rad T100. Después de la reacción, las mezclas se sometieron inmediatamente a análisis o se congelaron a -80 °C hasta el análisis.

Debido a los bajos niveles de 1- y d-Ala sin marcar extraídos de islotes y muestras de tejido acinar, se utilizaron columnas giratorias de desalinización de péptidos Pierce™ (Thermo Fisher, n.º de catálogo: 89851) para desalar y concentrar aminoácidos derivatizados de islotes reaccionados y muestras de tejido acinar. Las reacciones de Marfey terminadas se secaron usando el concentrador Eppendorf Vacufuge y se reconstituyeron en 150 µL de TFA al 0,1% en agua, seguido de pasos en el protocolo del fabricante con varias modificaciones para maximizar la recuperación, incluido un total de 3 veces para la carga de la muestra y 4 veces para elución de la muestra (2x con 50:50 ACN:Agua, 0,1% TFA, 2x con 80:20 ACN:Agua, 0,1% TFA). Luego las soluciones eluidas se secaron y almacenaron a -20 °C hasta el análisis.

Se realizó un análisis LC-MS/MS en modo de monitorización de reacciones múltiples (MRM). MRM permite la cuantificación del contenido de l/d-aminoácido de las muestras. En las mediciones de MRM se utilizó una cromatografía líquida de ultra alto rendimiento Bruker Elute acoplada a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Bruker EVOQ que funciona en modo ESI negativo. Los canales MRM se construyeron utilizando estándares de aminoácidos que reaccionaron con FDVA; Los detalles de los parámetros de origen y las transiciones MRM se pueden encontrar en las Tablas complementarias 4 y 5. Los aminoácidos l/d derivatizados se separaron usando una columna Kinetex® de 2,6 µm de fenil-hexilo 100 Å, 100 × 2,1 mm (Phenomenex, Cat. #: 00D-4495-AN) a 30°C. Se utilizó un gradiente de formiato de amonio 25 mM en agua (A) y metanol (B) a un caudal de 0,3 ml/min (0,4 ml/min durante 9,5 a 11 min). El gradiente es de 0 a 2 min, 95% A; 2 a 3,5 min, 95 a 78 % A; 3,5 a 6 min, 78 a 50 % A; 6 a 9 min, 50 a 45 % A; 9 a 9,5 min, 45 a 10 % A; 9,5 a 11 min, 10% A; 11–11,5 min, 10–95%A; 11,5-12 min, 95% A.

Para realizar el análisis LC-MS/MS, las mezclas de reacción se centrifugaron a 16.000 g durante 5 minutos a 4 °C y luego se diluyeron de 20 a 80 veces (principalmente 40 veces) en el tampón de carga que constaba de 95 % de fase móvil A. 5% de acetonitrilo y 2 μM de FDVA-l-Ser-13C,15N como estándar interno en la inyección instrumental. Los estándares se diluyeron al menos 40 veces con el tampón de carga. Se realizaron al menos dos inyecciones de muestras técnicas para todas las muestras dentro de cada ejecución de LC-MS. Para ejecuciones largas y continuas de LC-MS, se ejecutaron curvas de calibración al principio, en el medio y al final de toda la lista de muestras, y se resumió una curva de calibración maestra promediando todas las curvas de calibración. Se controlaron las áreas de los picos de FDVA en todas las muestras para calcular la cantidad sobrante de FDVA que quedó después de las reacciones de Marfey y se compararon con los blancos de reacción. Si el contenido de FDVA en las muestras (FDVA sobrante) era inferior al 20 % del blanco de reacción, lo que indica posibles reacciones incompletas, las muestras reconstituidas se diluían aún más y se volvían a reaccionar hasta que el FDVA sobrante era superior al 20 %. La diafonía entre canales para Ala, Ala-13C3, 15N, Ala-2,3,3,3-d4 y Ala-3,3,3-d3 derivatizados sin marcar se evaluó utilizando estándares en cada ejecución experimental para garantizar que la diafonía observada no afectan los resultados. Todas las muestras fueron medidas al menos dos veces en días diferentes por dos operadores independientes, excepto los tejidos de los islotes y acinares debido a sus bajas cantidades de muestra.

Para la cuantificación se utilizaron áreas de pico integradas por el software MS Data Viewer (Bruker). Las curvas de calibración cubiertas varían de 0,2 a 120 pmol para l-Ala derivatizado, 0,005 a 3 pmol para d-Ala, 0,2 a 200 pmol para d-Ala-13C3,15N, 0,005-2 para l-Ala-3,3,3 -d3, 0,0025-1 pmoles para d-Ala-3,3,3-d3, 0,0025-1 pmoles para l-Ala-2,3,3,3-d4 y 0,1-30 pmoles para l-Leu-5 ,5,5-d3 por inyección. Las áreas de los picos se normalizaron con respecto al área del pico de l-Ser-13C,15N derivatizado presente en la misma muestra mediante división. Se ajustaron regresiones lineales en rangos adecuados que cubren mejor las áreas de picos detectados en las muestras desconocidas. Cuando fue necesario, se realizaron regresiones lineales en dos segmentos para el mismo analito para cubrir mejor los rangos de concentración alta y baja; para curvas de calibración de rango de concentración baja, las curvas de calibración se configuraron para interceptar en (0,0). Todas las regresiones lineales alcanzaron R cuadrado >0,99 con muy varias excepciones. Después de la cuantificación de AA por inyección en muestras desconocidas utilizando áreas de pico y curvas de calibración, se calcularon cantidades de Ala no marcado, Ala marcado isotópicamente y 1-Leu-5,5,5-d3 para muestras reconstituidas y blancos. Se promediaron los resultados de las réplicas técnicas. La recuperación de analitos después del paso de filtración centrífuga se representó dividiendo la cantidad de 1-Leu-5,5,5-d3 en muestras desconocidas por las cantidades de 1-Leu-5,5,5-d3 en muestras de referencia, y se usó para Calcule la cantidad de Ala en la extracción de la muestra original antes de la filtración. Luego se restaron los valores en blanco de los blancos de extracción correspondientes. La concentración de Ala marcada con isótopos estables y sin marcar se calculó dividiéndola por diferentes métricas de muestra (p. ej., peso del tejido en mg para cerebro/glándulas salivales/intestinos/pituitaria/comida para ratones, peso del contenido intestinal en mg, μL para plasma, cantidades totales de proteína). para islotes/tejidos acinares). Los valores procesados ​​individuales se pueden encontrar en los Datos complementarios 1.

Para permitir comparaciones entre dos modelos de administración oral y entre diferentes tipos de muestras, realizamos varias estrategias de normalización. Para permitir la comparación entre dos escenarios de administración oral, las concentraciones de d-Ala-13C3,15N en varios tejidos/contenido intestinal en sus propias métricas (pmol sobre mg de tejidos/mg de heces/μg de proteínas) se dividieron por el d-Ala-13C3 en plasma. Nivel de 15N (pmol/μL de plasma) (Ec. 1):

Para permitir comparaciones entre diferentes tipos de muestras, ya que tienen diferentes métricas para representar las concentraciones, dividimos las concentraciones de d-Ala-13C3,15N entre el Ala total sin marcar en cada muestra para que no tengan unidades. Las concentraciones de d-Ala-13C3,15N se dividieron por el total de Ala sin marcar en la misma muestra, generando proporciones de d-Ala-13C3,15N sobre el total de Ala sin marcar en la misma muestra (Ec. 2) como un nivel relativo de d- Ala-13C3,15N:

Se realizó una normalización adicional para la Fig. 2 complementaria dividiendo dicha proporción por la proporción plasmática de d-Ala-13C3, 15N para contar las variaciones biológicas (Ec. 3):

Las réplicas presentadas en este estudio se refieren a individuos animales o tubos de cultivo de bacterias. Los puntos de datos utilizados en las figuras y para las estadísticas representan promedios de réplicas técnicas de múltiples mediciones. Se implementaron estadísticas no paramétricas para todos los datos obtenidos de las mediciones de LC-MS. Inicialmente, las pruebas t de Welch se realizaron debido a tamaños de muestra desiguales y/o varianzas desiguales. Sin embargo, debido al pequeño grado de libertad en las pruebas t de Welch paramétricas resultantes de los tamaños de muestra pequeños (n = 3-8), se eligieron pruebas no paramétricas de Mann-Whitney para comparaciones individuales por pares. Para los conjuntos de datos de las Figs. 2, 3c – e, 5b – e, pruebas de Mann-Whitney de dos colas. Para los conjuntos de datos de las figuras 5f – j, se utilizaron pruebas de Mann-Whitney de una cola debido al tamaño de la muestra (n = 3) y la separación completa observada en el conjunto de datos (U = 0). Se utilizó el ANOVA unidireccional de Friedman emparejado y no paramétrico seguido de la comparación múltiple de Dunn para determinar si los tipos de tejido contribuyen significativamente al nivel de d-Ala-13C3, 15N y para investigar las diferencias entre los tipos de tejido (Fig. 3f, g). Para los datos de perfiles peptídicos (Fig. 4), se seleccionaron pruebas t múltiples sin corregir con más suposiciones para maximizar el número de descubrimientos para estudios futuros debido a la naturaleza semicuantitativa de MALDI-TOF MS, el pequeño tamaño de la muestra (n = 4) y la naturaleza exploratoria de este experimento. El nivel de significancia (α) para todas las estadísticas se establece en 0,05 al describir la significación estadística. Todas las estadísticas se realizaron en GraphPad Prism 9.2.0.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de origen para todos los gráficos y tablas se pueden encontrar en el archivo de datos complementarios. Los datos procesados ​​que respaldan las conclusiones se presentan en el texto principal y en la información complementaria. Los datos originales están disponibles y se compartirán previa solicitud comunicándose con el autor correspondiente o el autor principal ([email protected]).

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Descargar referencias

Los autores agradecen al Dr. Fuming Pan y J. Reid McClure del Centro Gnotobiótico para Roedores de la UIUC por su ayuda en experimentos con animales libres de gérmenes. Agradecemos a Nissa J. Larson por su ayuda en los experimentos de BCA y al Dr. Peter Chan-Andersen por su ayuda en los experimentos de espectrometría de masas sobre perfiles de péptidos. Agradecemos a Theren Williams de la Oficina de Estadísticas de Illinois por su ayuda en estadística. Este trabajo fue apoyado por una beca postdoctoral del Instituto Beckman en UIUC de la Fundación Arnold y Mabel Beckman y una beca de investigación sobre muérdago de la Fundación Momental (TAQ), por el Programa de subvenciones para proyectos piloto de la Oficina del Vicerrector de Investigación de la Universidad de Illinois. , por el Premio No. R01NS031609 del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares de los Institutos Nacionales de Salud (JVS), y por el apoyo de la Subvención Pathway to Stop Diabetes de la Asociación Estadounidense de Diabetes No. 1-18-VSN-19 (JVS) . El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de las agencias de financiación.

Tian (otoño) Qiu

Dirección actual: Departamento de Química, Universidad Estatal de Michigan, East Lansing, MI, EE. UU.

Dong Kyu Lee

Dirección actual: Facultad de Farmacia, Universidad Chung-Ang, Seúl, República de Corea

Departamento de Química, Universidad de Illinois Urbana-Champaign, Urbana, IL, EE. UU.

Tian (Otoño) Qiu, Cindy J. Lee, Dong-Kyu Lee, Stanislav S. Rubakhin, Elena V. Romanova y Jonathan V. Sweedler

Instituto Beckman, Universidad de Illinois Urbana-Champaign, Urbana, IL, EE. UU.

Tian (Otoño) Qiu, Stanislav S. Rubakhin, Elena V. Romanova y Jonathan V. Sweedler

Programa de Neurociencia, Universidad de Illinois Urbana-Champaign, Urbana, IL, EE. UU.

Chen Huang, Stanislav S. Rubakhin, Elena V. Romanova y Jonathan V. Sweedler

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Tian (Otoño) Qiu: Conceptualización, Metodología, Validación, Análisis formal, Investigación, Visualización, Escritura (borrador original), Escritura: revisión y edición, administración de proyectos, adquisición de fondos. Cindy J. Lee: metodología, validación, análisis formal, investigación, redacción: revisión y edición. Chen Huang: análisis formal, investigación, redacción: borrador original. Stanislav S. Rubakhin: metodología, validación, recursos, redacción: revisión y edición. Dong-Kyu Lee: metodología, recursos, redacción: borrador original. Elena V. Romanova: Análisis formal. Jonathan V. Sweedler: conceptualización, recursos, redacción: revisión y edición, supervisión, adquisición de fondos.

Correspondencia a Jonathan V. Sweedler.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Jhen-Wei Ruan, Jukka Hintikka y al otro revisor anónimo por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: Mark Collins y Joao Valente.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Qiu, T. (., Lee, CJ, Huang, C. et al. Biodistribución y racemización de l/d-alanina absorbida en el intestino en ratones libres de gérmenes. Commun Biol 6, 851 (2023). https://doi .org/10.1038/s42003-023-05209-y

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Recibido: 02 de enero de 2023

Aceptado: 03 de agosto de 2023

Publicado: 16 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05209-y

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