El hidrolizado de Calanus finmarchicus mejora el rendimiento del crecimiento en ensayos de alimentación con juveniles de lubina europea y aumenta el crecimiento del músculo esquelético en estudios celulares

Apr 18, 2024

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12295 (2023) Citar este artículo

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El mundo dependerá del desarrollo de nuevos ingredientes alimentarios procedentes de fuentes renovables para garantizar el crecimiento sostenible de la industria acuícola. El zooplancton como Calanus finmarchicus son nuevos candidatos viables a materia prima, ya que tienen perfiles de nutrientes óptimos para los animales acuáticos y pueden recolectarse de manera sostenible en grandes volúmenes. En este estudio, el objetivo fue investigar si un hidrolizado de proteína de C. finmarchicus podía influir en el crecimiento de los peces. El efecto de la inclusión dietética de hidrolizados se probó en un ensayo de alimentación con juveniles de lubina europea (Dicentrarchus labrax), comparando el hidrolizado de calanus (CH) con los hidrolizados disponibles comercialmente. La dieta con inclusión de CH produjo un mayor crecimiento, con un peso corporal significativamente mayor que los hidrolizados de sardina y atún al final de la prueba. Los efectos promotores del crecimiento observados se examinaron más a fondo utilizando un modelo in vitro con células de músculo esquelético de salmón del Atlántico. A través de experimentos de bioactividad con células musculares cultivadas en medios que contienen CH, se descubrió que las fracciones de bajo peso molecular tenían el mayor efecto positivo sobre la proliferación, la viabilidad y la expresión de genes específicos del músculo. La caracterización de la fracción más potente reveló una abundancia de pequeños péptidos, junto con aminoácidos y metabolitos marinos asociados con un mayor crecimiento muscular.

Se prevé que la población mundial alcance los 9.800 millones en 20501, lo que requerirá un aumento correspondiente en la producción mundial de alimentos. Las fuentes de alimentos terrestres se están acercando a su capacidad máxima sostenible2, mientras que solo el 7% de todas las proteínas consumidas a nivel mundial provienen de productos del mar3. Los mariscos son ricos en proteínas digeribles y aminoácidos esenciales, y los animales acuáticos generalmente tienen un índice de conversión alimenticia (FCR) bajo en comparación con los animales terrestres, lo que permite un alto rendimiento de proteína dietética4. El potencial para alimentar a la creciente población con una mayor proporción de productos del mar es obvio, especialmente porque se espera que la demanda de fuentes de proteínas dietéticas con bajo impacto ambiental aumente considerablemente en los próximos años5.

Teniendo en cuenta la incertidumbre y la explotación actual de muchas pesquerías mundiales, se prevé que la acuicultura será la principal fuente de productos del mar en el futuro3,5. Junto con la expansión de la producción acuícola surgen dudas sobre su sostenibilidad, particularmente con respecto a los ingredientes necesarios para los piensos. Históricamente, la harina de pescado ha sido la fuente de proteína preferida en la acuicultura, pero sus variaciones estacionales y limitaciones de volumen han creado necesidades de fuentes de proteína adicionales en la creciente industria. Por lo tanto, la tendencia en los últimos años ha sido formular alimentos con cantidades cada vez mayores de proteínas vegetales terrestres como la soja, el maíz y la colza6. Las fuentes de proteínas vegetales terrestres tienen perfiles de aminoácidos subóptimos en comparación con las proteínas marinas, pueden contener factores antinutricionales y micotoxinas y, en general, muestran una menor palatabilidad7,8,9. Se ha demostrado que estos inconvenientes reducen el crecimiento de los peces de cultivo y han estimulado la demanda de ingredientes proteicos nuevos y sostenibles para la acuicultura. De los nuevos ingredientes propuestos, los recursos marinos poco tróficos, como el zooplancton, se consideran opciones atractivas y viables debido a sus volúmenes de biomasa renovable y su papel como alimento natural en la red alimentaria marina. Una especie de zooplancton con aplicaciones alimentarias es Calanus finmarchicus, que se encuentra en todo el hemisferio norte. Sólo en el Mar de Noruega y las regiones adyacentes, la producción anual de biomasa de C. finmarchicus y especies estrechamente relacionadas se estima en aproximadamente 290 millones de toneladas, lo que lo convierte en uno de los recursos renovables más importantes de la región10. Una revisión reciente sobre las especies mesopelágicas como nuevos recursos marinos destacó que la biomasa de C. finmarchicus se comprende bien y que el plan de gestión, que emite diez licencias de recolección comercial para una cuota anual total de 254.000 toneladas, rige su sostenibilidad biológica11. Los enormes volúmenes, combinados con una composición de nutrientes adecuada para los animales acuáticos12,13, hacen de C. finmarchicus una materia prima especialmente prometedora para nuevos ingredientes alimentarios para la acuicultura.

La hidrólisis enzimática de proteínas (EPH) es un método que se utiliza a menudo para procesar materia prima en ingredientes para piensos a escala industrial. EPH se basa en proteasas de calidad alimentaria para digerir biomasas ricas en proteínas, lo que normalmente da como resultado productos que constituyen una fracción peptídica soluble en agua, lípidos y una fracción sólida de residuos no solubles. Esta tecnología proporciona una alternativa suave y respetuosa con el medio ambiente a las técnicas de procesamiento con productos químicos como disolventes y ácidos. La fracción proteica aislada después del EPH se denomina hidrolizado y puede servir como un ingrediente importante en formulaciones de alimentos para peces14. Además de sus propiedades nutricionales y funcionales, los hidrolizados son fuentes potenciales de péptidos bioactivos específicos que pueden tener funciones biológicas diferentes a las de sus proteínas precursoras. Estos péptidos bioactivos pueden mostrar propiedades similares a hormonas o fármacos, y entre los modos de acción que pueden ejercer se encuentran los anabólicos (promotores del crecimiento), antioxidantes, antimicrobianos, antihipertensivos, inmunomoduladores y opioides15. Se ha demostrado que la inclusión de hidrolizados en las dietas de animales acuáticos promueve el crecimiento y aumenta la eficiencia alimenticia16, y una mirada más profunda a fracciones específicas de los hidrolizados podría ayudar a explicar algunos de estos efectos bioactivos. Estudios publicados anteriormente sobre EPH de C. finmarchicus se han centrado en cómo extraer la fase oleosa de forma más eficaz17; por lo tanto, hay poco conocimiento sobre la fracción proteica y cómo puede beneficiar el rendimiento del crecimiento de los peces.

En el estudio presentado, el objetivo general fue investigar si un hidrolizado de C. finmarchicus podría mejorar el crecimiento de las especies de peces de importancia comercial, lubina europea (Dicentrarchus labrax) y salmón del Atlántico (Salmo salar). La primera parte consistió en un ensayo de alimentación que evaluó cómo la inclusión dietética de hidrolizado de calanus influía en el rendimiento del crecimiento de la lubina europea, comparándola con otros hidrolizados marinos comerciales. La mejora del crecimiento observada con el hidrolizado de calanus en la prueba de alimentación se estudió más a fondo en la segunda parte, utilizando un modelo de células del músculo esquelético del salmón del Atlántico para identificar fracciones bioactivas del hidrolizado asociadas con un mayor crecimiento del músculo esquelético.

La inclusión en la dieta de un nuevo hidrolizado de proteína del zooplancter marino C. finmarchicus mejoró el crecimiento de la lubina europea en un ensayo de alimentación que comparó los hidrolizados de proteína marina como ingredientes funcionales del alimento. Las propiedades de promoción del crecimiento observadas del hidrolizado de calanus (CH) se evaluaron adicionalmente utilizando un modelo celular in vitro para músculo esquelético. Las evaluaciones de cómo la suplementación con CH en el medio de cultivo celular afectó la viabilidad, la proliferación y la expresión genética en estudios celulares, seguidas del fraccionamiento de CH, condujeron a la identificación y caracterización de la fracción más bioactiva asociada con un mayor crecimiento de las células musculares. En la Fig. 1 se presenta un resumen del flujo de trabajo.

Representación esquemática de los métodos utilizados para examinar las propiedades promotoras del crecimiento de un hidrolizado de Calanus finmarchicus. (A) Prueba de alimentación con lubina europea. (B) Estudios de bioactividad del hidrolizado de calanus. CCH: Hidrolizado de calanus crudo; DCH: Hidrolizado de calanus desalado; F1-F6: fracción 1–6; SEC: cromatografía de exclusión por tamaño; RMN: Espectroscopia de resonancia magnética nuclear.

El ensayo de alimentación tuvo como objetivo comparar los efectos promotores del crecimiento del hidrolizado de calanus (CH) en la dieta frente a los hidrolizados de proteínas marinas disponibles comercialmente de sardina (SDH), atún (TH) y salmón (SH). Se han documentado bien niveles moderados de inclusión (5–10%) de hidrolizados de proteínas marinas para mejorar el crecimiento de los peces14. Los hidrolizados marinos también pueden mejorar las propiedades nutricionales para estimular el consumo de alimento18, aumentar la ingesta de nutrientes y mejorar el crecimiento, como se observa en las dietas iniciales para el salmón del Atlántico19. Comparar el CH con ingredientes funcionales similares, empleando así dietas con hidrolizados marinos comerciales como controles, podría decirse que arrojaría resultados más relevantes que compararlo con una dieta de control estándar de harina de pescado.

Los juveniles de lubina europea con un peso inicial de 8,9 ± 0,4 g aceptaron plenamente todas las dietas. Con un peso inicial similar para todos los grupos que recibieron las diferentes dietas y variaciones iguales (Tabla S7.1-S7.3 en datos complementarios), se aplicó ANOVA unidireccional para comparar los parámetros en diferentes puntos temporales. No se observaron efectos significativos sobre la supervivencia, la composición corporal total o la ingesta de alimento (Tablas S3 a S6 en datos complementarios). Sin embargo, la inclusión de CH produjo un peso corporal significativamente mayor que SDH (p = 0,003) y TH (p = 0,047) después de 84 días (Fig. 2A) y mostró una mayor tasa de crecimiento en comparación con SDH (p = 0,002) durante todo el ensayo (Fig. .2B). El rendimiento del crecimiento está estrechamente relacionado con la capacidad de convertir nutrientes en peso corporal, y la relación entre el aumento de peso corporal y la proteína consumida es el índice de eficiencia proteica (PER), que se puede utilizar para evaluar la calidad de los ingredientes proteicos de la dieta. Los peces que recibieron CH en la dieta mostraron un PER más alto durante todo el ensayo (Fig. 2C), con resultados finales significativamente más altos en comparación con los hidrolizados comerciales SDH (p = 0,002), TH (p = 0,011) y SH (p = 0,037). El índice de conversión alimenticia (FCR) mide la eficiencia con la que los peces convierten su insumo (alimento) en el resultado deseado (peso corporal), por lo que tiene en cuenta todo el alimento, no solo la proteína. Al final de la prueba, los alimentos que contenían los tres hidrolizados comerciales tenían FCR que oscilaban entre 1,28 y 1,33, mientras que CH tenía un FCR de 1,22, significativamente más bajo que el de SDH y TH (Fig. 2D). Estos valores de FCR se corresponden bien con los encontrados en estudios similares con hidrolizados dietéticos para lubina europea20.

Evaluación comparativa de los hidrolizados marinos como ingredientes alimentarios para el rendimiento del crecimiento y la utilización del alimento en la lubina europea (Dicentrarchus labrax). (A) Peso corporal: los peces se pesaron en grupo para cada tanque. (B) Tasa de crecimiento específica (SGR): [(en peso final – en peso inicial)/número de días] × 100. (C) Relación de eficiencia proteica (PER): ganancia de peso húmedo/ingesta de proteína cruda. (D) Índice de conversión alimenticia (FCR): consumo de alimento crudo/aumento de peso. CH: hidrolizado de Calanus; SDH: hidrolizado de sardina; TH: Hidrolizado de atún; SH: Hidrolizado de salmón. Las barras son medias ± desviación estándar (n = 3). Letras diferentes denotan diferencia estadística (P <0,05).

Los resultados del ensayo de rendimiento del crecimiento resaltan el potencial del CH como ingrediente funcional en los alimentos para peces, lo que demuestra que la inclusión de CH en la dieta puede mejorar el crecimiento y aumentar la retención general de proteínas y la conversión alimenticia.

Hasta donde sabemos, este es el primer estudio publicado que utiliza un hidrolizado de proteína de C. finmarchicus en un ensayo de alimentación; por lo tanto, hay pocas comparaciones directas que puedan realizarse. Sin embargo, un estudio indicó que la suplementación con harina de C. finmarchicus en las dietas para juveniles de fletán del Atlántico (Hippoglossus hippoglossus) podría mejorar en gran medida la tasa de crecimiento y la eficiencia de utilización de nutrientes21. La comida fue procesada para aumentar su contenido de proteínas, pero a diferencia de los hidrolizados de proteínas óptimos, también contenía cantidades considerables de lípidos. Otro estudio con proteína de zooplancton demostró que la inclusión en la dieta de harina de krill antártico (Euphausia superba) de la lubina europea mejoraba el rendimiento del crecimiento y la eficiencia alimenticia22. Los evidentes beneficios de incluir zooplancton como C. finmarchicus y krill antártico en las dietas de los peces no deberían sorprender, ya que el zooplancton es un alimento natural para la mayoría de las especies de peces, especialmente en las primeras etapas de su vida. Sin embargo, se sabe poco sobre por qué el zooplancton y sus productos benefician sustancialmente el crecimiento, y los experimentos posteriores investigan estas propiedades con más detalle.

Considerando que las dietas eran isonitrogénicas, isolipídicas e isoenergéticas (Tabla 3, Materiales y métodos), y que no hubo diferencias significativas en el consumo de alimento entre ellas, cualquier diferencia observada en el rendimiento del crecimiento se basaría enteramente en la composición y propiedades de las dietas. hidrolizados individuales. La composición y las propiedades de los hidrolizados de proteínas marinas pueden ser diferentes según la fuente de materia prima, las enzimas utilizadas para la hidrólisis y las condiciones y duración de la hidrólisis18. En varios estudios23,24 se ha encontrado evidencia de que ciertas fracciones de hidrolizado pueden influir en el rendimiento del crecimiento de los peces de múltiples maneras.

El primer experimento de bioactividad in vitro se realizó para determinar si el contenido mineral natural del CH afectaba el crecimiento del músculo esquelético, utilizando un modelo con células primarias del músculo esquelético del salmón del Atlántico. La lubina europea y el salmón del Atlántico son especies de peces teleósteos y comparten los eventos fundamentales de la miogénesis25. Las células del músculo esquelético primario del salmón son modelos bien establecidos para experimentos de bioactividad para estudiar el crecimiento muscular y sus mecanismos26,27,28,29,30.

Se agregaron tres concentraciones de CH crudo y desalado a los medios de crecimiento para probar si la suplementación de estos podría afectar la viabilidad, proliferación y citotoxicidad de las células musculares. La actividad metabólica celular aumentó significativamente cuando el medio de cultivo celular se complementó con CH desalado en concentraciones de 1 mg/ml y 0,1 mg/ml (Fig. 3A), en comparación con las células tratadas con medio de control (sin hidrolizados añadidos). La proliferación celular no se vio afectada, excepto cuando las células se trataron con medio de cultivo que contenía CH crudo a 0,1 mg/ml (Fig. 3B). Solo la concentración más alta de CH crudo (1 mg/ml) suplementada en medios de cultivo celular indujo un aumento de los niveles de lactato deshidrogenasa (LDH) en las células, lo que podría afectar negativamente la supervivencia celular (Fig. 3C).

Viabilidad (A), proliferación (B) y citotoxicidad (C) de células musculares de salmón del Atlántico cultivadas en medios de crecimiento suplementados con tres concentraciones (0,01, 0,1 o 1 mg/ml de CH en medio de crecimiento) de hidrolizado de calanus crudo o desalado. CH: hidrolizado de Calanus; RFU: Unidades de fluorescencia relativas; LDH: lactato deshidrogenasa; CTL: Control (sin hidrolizado añadido al medio de crecimiento del cultivo celular). Los resultados se presentan con gráficos de caja (percentiles 25 a 75 con línea en la mediana) y bigotes (mínimo a máximo) (n = 4). Las estrellas (*) denotan diferencias estadísticamente significativas con respecto al control (P <0,05).

El experimento de bioactividad inicial mostró que los hidrolizados desalados funcionaron mejor en estudios celulares (Fig. 3). Una supuesta explicación es que las células cultivadas son vulnerables a contenidos minerales superiores a sus concentraciones innatas, ya que las altas concentraciones de minerales pueden provocar un efecto osmótico en el que las células pierden agua y se encogen31. Mientras que las células cultivadas pueden reaccionar negativamente a contenidos elevados de minerales, lo contrario ocurre con la mayoría de los animales acuáticos, especialmente los de origen marino, que requieren cantidades significativas de micronutrientes como minerales en sus dietas32. No obstante, los resultados sugieren que los efectos positivos que el CH tiene sobre el crecimiento muscular se deben a sus péptidos inherentes, no a su contenido mineral, por lo que se eligió el CH desalado para los experimentos in vitro restantes.

Como siguiente paso para reducir aún más la lista de compuestos potencialmente bioactivos en el CH, el CH desalado se fraccionó para investigar cómo las fracciones de péptidos de diferentes tamaños afectan el crecimiento muscular. El CH se separó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y produjo seis fracciones con pesos moleculares promedio de >742 Da (F1), 742 Da (F2), 527 Da (F3), 407 Da (F4), 316 Da (F5). y 260 Da (F6). Luego, las células musculares se cultivaron en medios de crecimiento que contenían cada una de las fracciones peptídicas para medir su influencia individual, mientras que las células de control se cultivaron en medios de crecimiento sin suplementación de fracciones peptídicas. F3, F4 y F6 se asociaron con la mayor viabilidad celular, significativamente mayor que el control y las fracciones F1 y F2, mientras que F5 mostró un efecto intermedio (Fig. 4A). Asimismo, el medio de cultivo celular suplementado con F6 indujo la mayor capacidad proliferativa, significativamente mayor que el control y F5 (Fig. 4B). En general, los resultados mostraron que las fracciones de menor peso molecular afectaron el crecimiento muscular de manera más positiva que las de mayor peso molecular. Esto es consistente con estudios previos que mostraron efectos promotores del crecimiento de péptidos de pequeño peso molecular33. Bakke et al.23 revelaron que los pequeños péptidos y aminoácidos formados durante la hidrólisis pueden facilitar la absorción de moléculas en el tracto intestinal al aumentar la expresión de los transportadores de péptidos. Rashidia, et al.34 encontraron que las fracciones de bajo peso molecular del hidrolizado de desechos de camarón pueden mejorar el rendimiento del crecimiento de la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss), y Zheng et al.24 indicaron un efecto positivo sobre el crecimiento y la utilización del alimento en rodaballo juvenil (Scophthalmus maximus). mediante el uso de compuestos de bajo peso molecular procedentes del hidrolizado de proteínas de pescado. También se ha demostrado que las fracciones de bajo peso molecular de los hidrolizados de proteínas son más bioactivas en estudios de células musculares primarias de mamíferos35,36.

Viabilidad (A) y actividad proliferativa (B) de células musculares de salmón del Atlántico cultivadas en medios de crecimiento suplementados con seis fracciones separadas por tamaños de CH desalado (0,1 mg/ml). RFU: Unidades de fluorescencia relativas; CTL: Controlar; F1-F6: CH fracciones 1 a 6. Los resultados se presentan con gráficos de caja (percentiles 25 a 75 con línea en la mediana) y bigotes (mínimo a máximo) (n = 5). Las letras minúsculas (a, b, c) denotan diferencias estadísticamente significativas (P <0,05).

Se eligieron las dos fracciones más prometedoras de los ensayos de viabilidad (F4 y F6) y proliferación (F6) para el análisis de expresión génica. Se analizó la expresión de genes asociados con el crecimiento muscular en células cultivadas en medios suplementados con F4 y F6, para explorar la influencia de estas potentes fracciones con más detalle. La proliferación y diferenciación de mioblastos a miotubos multinucleares requiere la expresión de genes que codifican factores reguladores musculares como el factor miogénico 5 (Myf5) y la proteína de determinación de mioblastos 1a (MyoD1a)37,38. Myf5 y MyoD1a son marcadores tempranos responsables de la especificación de células en el linaje muscular25. Los factores reguladores del músculo son esenciales para la transcripción de varios genes específicos del músculo, lo que da como resultado una mayor expresión de proteínas musculares estructurales como la cadena pesada de miosina (MHC). En la diferenciación de las células musculares, los marcadores tempranos se regularán a la baja, mientras que los marcadores tardíos, como las proteínas musculares estructurales, se regularán al alza25. Las células musculares cultivadas en medios de crecimiento con F4 no afectaron la expresión génica de myf5 o myod1a, mientras que F6 indujo una regulación negativa de ambos genes (Fig. 5A y B). Aunque los resultados estuvieron justo por debajo del límite estadístico establecido para la significación, hubo una tendencia hacia una mayor expresión de mhc (Fig. 5C), y F6 mostró la mayor regulación positiva (p = 0,0518). Una regulación negativa de los marcadores musculares tempranos myf5 y myod1a, concomitantemente con una regulación positiva tendencial de mhc, puede indicar que las fracciones de péptidos CH afectaron positivamente a las células musculares al aumentar su tasa de diferenciación. Los efectos positivos observados en la diferenciación de las células musculares in vitro podrían explicarse por la composición de ciertos péptidos pequeños y aminoácidos en F4 y F6. Se ha descubierto previamente que la suplementación de aminoácidos glutamato y arginina en células musculares de salmón del Atlántico cultivadas in vitro influye en la expresión genética de marcadores específicos del músculo tanto tempranos como tardíos, incluyendo miogenina, Myf5, MyoD1a, Myf6 y la cadena ligera de miosina27.

Expresión génica relativa de los factores reguladores musculares myf5 (A) y myod1a (B) y la proteína estructural muscular mhc (C) tras 72 h de incubación con medios de cultivo celular suplementados con diferentes fracciones de CH (F4 y F6). myf5: factor miógeno 5; myod1A: proteína 1A de determinación de mioblastos; mhc: cadena pesada de miosina; Expresión genética relativa (RGE); CTL: controlar, F4; fracción 4 de CH; F6: fracción CH F6. Los resultados se presentan con diagramas de caja (mínimo a máximo con línea en la media, n = 3). Letras diferentes denotan diferencias estadísticas (P < 0,05).

Las dos fracciones de CH de bajo peso molecular que mostraron el mayor efecto sobre la viabilidad (F4 y F6) y la proliferación (F6) de las células musculares del salmón del Atlántico se analizaron más a fondo para estudiar la distribución del peso molecular de los péptidos. En comparación con el CH crudo, se demostró que tanto F4 como F6 constituyen cantidades relativamente bajas de proteínas grandes de elución temprana y grandes cantidades de péptidos de peso molecular más pequeño de elución tardía (Fig. 6). Se calculó que los pesos moleculares promedio de los péptidos en las fracciones eran 407 y 260 g/mol para F4 y F6, respectivamente, que corresponden aproximadamente a péptidos con una longitud promedio de 3,6 y 2,3 residuos de aminoácidos (calculados usando un peso molecular promedio ponderado de 113 g/mol para aminoácidos individuales). Estos resultados indican que los efectos de promoción del crecimiento observados en el ensayo de alimentación y en los estudios in vitro pueden atribuirse potencialmente a los péptidos de bajo peso molecular en CH, que se sabe que tienen una absorción eficiente por parte de los transportadores de péptidos en los intestinos39 y mejoran el rendimiento del crecimiento34.

Distribución de peso molecular de CH crudo y fracciones F4 y F6 adquiridas mediante cromatografía de exclusión por tamaño con monitorización UV (214 nm).

Identificada como la fracción más bioactiva en términos de viabilidad, proliferación y expresión génica de células musculares cultivadas in vitro, F6 se caracterizó además con espectroscopia de RMN 1H (Fig. 7). Las asignaciones provisionales de los picos de RMN de protones se realizaron de acuerdo con los valores de desplazamiento químico publicados para muestras estrechamente relacionadas40,41,42. Además de las señales características asignadas a las cadenas laterales de aminoácidos aromáticos y alifáticos, se asignaron señales significativamente grandes a metabolitos marinos comunes como el N-óxido de trimetilamina (TMAO) y la dimetilglicina (DMG). Particularmente interesante fue la abundancia de DMG en combinación con los aminoácidos de cadena ramificada (BCAA). Se ha demostrado que la suplementación con sal DMG en las dietas mejora el rendimiento del crecimiento y la función del músculo esquelético en animales terrestres43,44 y la inclusión de BCAA en los alimentos acuícolas contribuye al crecimiento y la calidad de la carne45. El glutamato y la arginina, los aminoácidos antes mencionados que aumentan la expresión de genes específicos del músculo27, también se identificaron como parte de varios picos abundantes en la fracción. El lactato es otro metabolito identificado en la fracción que se ha asociado con la estimulación del crecimiento. Se ha informado que desempeña un papel en la respuesta de la hormona del crecimiento humano inducida por el ejercicio46, estimula la hipertrofia y la regeneración del músculo esquelético del ratón47 y estimula el crecimiento cuando se complementa con la dieta de salvelinus alpinus48.

Espectros de RMN 1H de CH-F6 con asignaciones provisionales basadas en valores de desplazamiento químico informados anteriormente. Se realizaron asignaciones para los picos abundantes y solo se asignaron picos diagnósticos para una molécula determinada. Los picos no asignados están marcados con "*".

La inclusión dietética de hidrolizado de calanus (CH) en un ensayo de alimentación con juveniles de lubina europea condujo a un mayor rendimiento del crecimiento y eficiencia alimenticia en comparación con otros hidrolizados marinos comerciales, destacando el potencial del CH como ingrediente funcional en la alimentación de peces. En el siguiente estudio in vitro, las fracciones de CH de bajo peso molecular se asociaron con una mayor viabilidad y actividad proliferativa en un modelo de células de músculo esquelético de salmón. Además, un experimento de expresión genética mostró una regulación negativa de los marcadores musculares tempranos y una tendencia hacia una mayor expresión de un marcador muscular estructural, lo que puede indicar un efecto positivo en la diferenciación muscular. La caracterización de la fracción más bioactiva mediante 1H NMR reveló que contenía pequeños péptidos y aminoácidos importantes, pero también metabolitos que previamente se habían asociado con un mayor crecimiento muscular. Se requieren más estudios para cuantificar la contribución directa de dichos metabolitos a los efectos promotores del crecimiento observados. Hasta donde saben los autores, el presente estudio es el primero en demostrar el potencial prometedor del CH como ingrediente alimentario con componentes específicos que promueven el crecimiento.

La materia prima de Calanus finmarchicus fue recolectada y procesada en hidrolizado de calanus (CH) por Calanus AS (Tromsø, Noruega), y los hidrolizados comerciales de salmón (SH), sardina (SDH) y atún (TH) fueron comprados y suministrados por SPAROS. , Lda. (Olhao, Portugal). Los hidrolizados de calanus y salmón se utilizaron en forma líquida, mientras que los de sardina y atún eran polvos secos. La composición de nutrientes de los hidrolizados de prueba se presenta en la Tabla 1.

Las cuatro dietas experimentales en el ensayo se formularon con niveles bajos de harina de pescado y gluten de trigo, compensados ​​con los productos de prueba de hidrolizados marinos (calanus, salmón, sardina y atún) y proteínas vegetales adicionales (Tabla 2). Para que todas las dietas fueran equivalentes en términos de suministro de proteínas, el nivel de inclusión de los hidrolizados osciló entre 2,95% y 4,20% (base seca) en función de su diferente contenido de proteína cruda (Tabla 1). En general, las dietas formuladas fueron isonitrogénicas (48% de proteína cruda), isolipídicas (16% de grasa cruda) e isoenergéticas (21,9 MJ/kg).

Las dietas se produjeron por extrusión en SPAROS. Todos los ingredientes en polvo se mezclaron según la formulación objetivo en un mezclador de doble hélice (modelo RM90, MAINCA, España) y se molieron (por debajo de 250 µm) en un molino de martillos micropulverizador (modelo SH1, Hosokawa-Alpine, Alemania). Los hidrolizados de prueba de calanus y salmón, presentados en forma líquida, se incorporaron al puré de alimento después de la molienda. Las dietas (tamaños de pellets: 1,5 y 2,0 mm) se fabricaron con una extrusora de doble tornillo (modelo BC45, Clextral, Francia) con un diámetro de tornillo de 55,5 mm. Las condiciones de extrusión fueron las siguientes: velocidad de alimentación (44 kg/h), velocidad del tornillo (142 rpm), adición de agua (aproximadamente 290 ml/min), temperatura del barril 1 (24–29 °C), temperatura del barril 3 (105–107 °C). Los gránulos extruidos se secaron en un secador de lecho fluido vibratorio (modelo DR100, TGC Extrusion, Francia). Después del enfriamiento, se agregaron aceites después de la extrusión mediante recubrimiento al vacío (modelo PG-10VCLAB, Dinnissen, Países Bajos). Los gránulos completos se empaquetaron en cubos de plástico sellados y se enviaron al sitio de investigación, donde se almacenaron a temperatura ambiente, en un ambiente fresco y bien aireado. Se tomaron muestras de cada dieta para su caracterización analítica (Tabla 3, Tablas S1-S2 en datos complementarios). Los análisis de los piensos completos se realizaron con duplicados analíticos, siguiendo la metodología descrita por AOAC49 para la mayoría de los análisis: Materia seca después del secado a 105 °C durante 24 h; ceniza total por combustión (550 °C, 6 h) en horno de mufla (Nabertherm L9/11/B170, Alemania); proteína cruda (N × 6,25) mediante una técnica de combustión instantánea seguida de separación cromatográfica de gases y detección de conductividad térmica con un analizador Leco N (Modelo FP-528, Leco Corporation, EE. UU.); lípidos crudos mediante extracción con éter de petróleo (40–60 °C) utilizando un sistema Soxtherm (Multistat SX PC, Gerhardt, Alemania); energía bruta en una bomba calorimétrica adiabática (Werke C2000, IKA, Alemania). Los aminoácidos se determinaron después de la hidrólisis en HCl 6 M a 108 °C durante 24 h en viales lavados con nitrógeno, utilizando un sistema de HPLC de fase inversa Waters Pico-Tag con norleucina como estándar interno. Los cromatogramas resultantes se analizaron con el software Breeze (Waters, EE. UU.). El triptófano no fue analizado debido a su destrucción por hidrólisis ácida. Los minerales y ácidos grasos se analizaron en un laboratorio certificado (Eurofins Anàlisis Alimentario SL, España), según la norma ISO 27.085:2009 mediante metodología ICP-AES50 para minerales, y mediante cromatografía de gases y detección de ionización de llama (GC-FID) para ácidos grasos. .

La prueba de alimentación se llevó a cabo en las instalaciones experimentales de SPAROS (Olhão, Portugal), que están registradas para la experimentación con especies acuáticas por la Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (Ministerio de Agricultura, Portugal). El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Bienestar Animal—Órgão Responsável pelo Bem-Estar Animal (ORBEA) de SPAROS (referencia del ensayo: CALBASS). Los experimentos fueron realizados por científicos y personal técnico certificado por FELASA, en pleno cumplimiento de las directrices ARRIVE y de la legislación europea (Directiva 2010/63/UE) y portuguesa (Decreto-Lei nº. 113/2013, de 7 de agosto) sobre protección de animales para fines científicos.

La prueba se realizó en las instalaciones de investigación experimental de SPAROS (Olhão, Portugal), con lubina europea (Dicentrarchus labrax) procedente de la Estação Piloto de Piscicultura de Olhão (EPPO) del Instituto Portugués del Mar y la Atmósfera (IPMA). Aproximadamente 650 peces fueron trasladados a las instalaciones experimentales de SPAROS por un transportista debidamente autorizado y no se observó mortalidad significativa ni signos patológicos asociados con el transporte. Los peces se mantuvieron en cuarentena sanitaria durante tres semanas, durante las cuales se mantuvieron y alimentaron con una dieta comercial estándar, antes del inicio del ensayo.

Se distribuyeron un total de 360 ​​peces en 12 tanques (30 peces por tanque), con tres tanques para cada una de las dietas experimentales. Se formularon cuatro dietas experimentales (Tabla 2), cada una con la inclusión de un hidrolizado marino (calanus, sardina, atún o salmón). El peso corporal inicial medio de los peces fue de 8,9 ± 0,4 g y fueron alimentados con las dietas experimentales durante 84 días. Los tanques subcuadrados de PVC contenían 90 L de agua y se ubicaron en el interior, se les abasteció con agua salada (caudal: 4,6 L/min) y se sometieron a condiciones de fotoperiodo de 12 h de luz y 12 h de oscuridad. La temperatura promedio del agua durante la prueba fue de 23,0 ± 1,4 °C, la salinidad fue de 35,8 ± 0,5 ‰, los niveles de oxígeno disuelto en el agua se mantuvieron por encima de 5,3 mg/L y los niveles de amoníaco estuvieron por debajo del límite de detección.

Los peces fueron alimentados manualmente hasta la saciedad visual en cuatro comidas diarias a las 09:00, 12:00, 15:00 y 18:00. Se tuvo sumo cuidado para evitar el desperdicio de alimento y permitir una cuantificación precisa de la ingesta. Se pesaron en grupo peces ligeramente anestesiados (20 ml/l de AQUI-S, Nueva Zelanda) al inicio, el día 30, el día 67 y finalmente el día 84. Se calculó el consumo de alimento, se monitoreó diariamente la supervivencia y se registró el rendimiento del crecimiento. en los días antes mencionados. Se calcularon el índice de conversión alimenticia (FCR), el índice de eficiencia proteica (PER) y la tasa de crecimiento específico (SGR) (n = 3) al finalizar el ensayo utilizando estas fórmulas:

FCR: consumo de alimento crudo/aumento de peso.

PER: aumento de peso húmedo/ingesta de proteína cruda.

SGR: (Ln peso corporal final – Ln peso corporal inicial) × 100/días.

Se liofilizó hidrolizado de calanus crudo (CCH, 46 % de materia seca) para producir un polvo de color marrón claro. Para refinar aún más los péptidos del hidrolizado crudo, se diluyó CCH 1:1 en agua Milli-Q, se filtró usando un filtro de jeringa Millex con una membrana de PVDF (tamaño de poro 0,45 μm, Merk Millipore, Burlington, MA, EE. UU.) y se desalinó usando semi -cromatografía preparativa. Los fraccionamientos se realizaron utilizando un instrumento Dionex Ultimate 3000 (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) equipado con una bomba cuaternaria y un termómetro de muestra automática, y un detector de UV de longitud de onda variable. La desalinización se realizó utilizando una columna Thermo Betasil C18 de fase inversa, 250 × 10 mm de diámetro interior, tamaño de partícula de 10 μm (Thermo Scientific). La fase móvil utilizada fue H2O (Disolvente A) y acetonitrilo (Disolvente B), ambos acidificados con ácido fórmico al 0,1%. Se utilizó el siguiente perfil de elución a un caudal de 2 ml/min: 0 min, 0 % B; 10,0 min, B al 0%; 35,0 min, 100% B; 41,0 min, 100% B; 51,0 min, 0 % B. Las fracciones de hidrolizado de calanus desalado (DCH) se recogieron entre 5,2 min y 35,0 min de tiempo de retención y se liofilizaron para proporcionar un polvo amarillo claro. Tanto el CCH como el DCH liofilizados se utilizaron directamente para el cribado inicial en los ensayos de cultivo celular. El DCH se fraccionó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión molecular (SEC). El fraccionamiento basado en el peso molecular se realizó utilizando el mismo sistema descrito anteriormente y una columna preparativa Yarra SEC-2000, 300 × 21,1 mm de diámetro interior, tamaño de partícula de 5 µm (Phenomenex, Torrence, CA, EE. UU.). La fase móvil estuvo compuesta por una mezcla de acetonitrilo y agua ultrapura en una proporción de 30:70 (v/v), que contenía 0,1% de ácido fórmico. Como solución de inyección se utilizó CCH diluido 1:1 en agua Milli-Q filtrada usando un filtro de jeringa Millex con una membrana de PVDF. La separación cromatográfica se realizó mediante elución isocrática con acetonitrilo al 30% (ácido fórmico al 0,1%) a un caudal de 3 ml/min de 0 a 55 min. A esto le siguió un lavado durante 3 minutos con NaH2PO4 (0,10 M) y un posterior equilibrio de la columna durante 20 minutos con acetonitrilo al 30%. Se recogieron fracciones de un total de 15 inyecciones de 500 µl. Se recogieron, combinaron y liofilizaron un total de seis fracciones CH-F1 a CH-F6 antes del análisis con cultivos celulares. Las fracciones activas (F4 y F6) identificadas en el estudio de cultivo celular se analizaron para determinar la distribución del peso molecular utilizando el protocolo de Wubshet et al.51.

Se aislaron células musculares esqueléticas primarias de salmón del Atlántico según Østbye e Ytteborg 28. Las células musculares aisladas se sembraron en matraces de células T25 (tejido muscular de ocho salmones de 5 cm por matraz de células T25) con medio de crecimiento que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10 %. , HEPES 0,01 M (Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.), 10 ml/l de antibiótico-antimicótico (Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.), en medio L-15 GlutaMAX (Invitrogen, Carlsbad, EE. UU.). Las células se incubaron a 13 °C sin CO2 durante 2 días. Luego, las células se tripsinaron y se transfirieron a placas de 96 pocillos para ensayos de viabilidad o proliferación o a placas de 6 pocillos para análisis de expresión génica. Después de un día de incubación a 13 °C sin CO2, a las células se les añadió medio de crecimiento que contenía FBS al 2% y diferentes concentraciones de hidrolizado de calanus. Las células se incubaron con hidrolizados durante 72 h antes de recolectarlas para los diferentes análisis.

Se realizaron dos ensayos celulares separados para investigar el efecto del hidrolizado de calanus en el crecimiento del músculo esquelético del salmón del Atlántico. En el primer ensayo celular, se probaron tres concentraciones (1,00, 0,10 y 0,01 mg/ml, pH 7) de hidrolizados de calanus crudos y desalados para determinar la viabilidad, toxicidad y proliferación de las células. En el segundo ensayo celular, se investigaron seis fracciones separadas por tamaños diferentes (F1-F6) del hidrolizado desalado (0,10 mg/ml) mediante ensayos de viabilidad y proliferación. Sólo se incluyeron F4 y F6 para el análisis de expresión génica.

La viabilidad de las células se evaluó midiendo la producción de ATP con CelltiterGlo (Promega Corporation, Madison, WI, EE. UU.), la toxicidad potencial de los hidrolizados utilizando el kit de detección de citotoxicidad (LDH) (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) y la proliferación de las células. utilizando el ensayo de proliferación celular CyQUANT (Molecular Probes, Oregon, EE. UU.), siguiendo los protocolos del fabricante.

Se utilizó el kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA, EE. UU.) para aislar el ARN total de las células musculares siguiendo el protocolo del productor. Todas las muestras se trataron con DNasa I (Invitrogen, Carlsbad, EE. UU.) para eliminar el ADN genómico. La concentración y pureza del ARN se evaluaron utilizando el espectrofotómetro NanoDrop 1000 (NanoDrop Technologies, EE. UU.). Se utilizaron reactivos de transcriptasa inversa Taqman (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) para sintetizar ADNc a partir de 500 ng de ARN en un volumen de reacción de 20 μL de acuerdo con las siguientes condiciones: 25 °C durante 10 min, 37 °C durante 30 min. y 95°C por 5 min. La mezcla de reacción de qPCR consistió en 4 µl de ADNc diluido (1:10), 1 µl de cebador directo e inverso a una concentración final de 0,5 µM (Tabla S8 en datos complementarios) y 5 µl de PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster Ciudad, California, Estados Unidos). Se incluyó una curva estándar para cada par de cebadores para evaluar la eficiencia del cebador y se incluyó un análisis de la curva de fusión para verificar la amplificación de un solo producto. Todas las muestras se analizaron en paralelo y se incluyeron controles sin plantilla ni enzima. La reacción qPCR se ejecutó en un instrumento QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, MA, EE. UU.) en las siguientes condiciones: 50 °C durante 20 s, 95 °C durante 20 s, 40 ciclos con 95 °C durante 1 s y 60 ° C durante 20 s, 95 °C durante 1 s y 60 °C durante 20 s, 95 °C durante 1 s. Se utilizó RefFinder52 para evaluar el gen de referencia más estable de ef1a, rpol2 y etif3. El nivel relativo de expresión génica se calculó según el método ΔΔCt con corrección de eficiencia53 utilizando rpol2 como gen de referencia.

El análisis de RMN 1H de la fracción prometedora (F6) se realizó utilizando un sistema Bruker Ascend (frecuencia operativa 1H de 400 MHz) equipado con un cambiador de muestras y un cabezal de sonda de 5 mm de triple resonancia inversa de gradiente (Bruker Biospin). La muestra de RMN se preparó disolviendo aprox. 5 mg de CH-F6 en 0,7 ml de D2O que contienen 0,05 % en peso. % Sal sódica de TMSP-d4 como estándar interno. Se usó IconNMR (versión 4.2, Bruker Biospin) para controlar la adquisición automatizada de datos de RMN (equilibrio de temperatura a 300 K, optimización de los parámetros de bloqueo, ajuste de gradiente y configuración de la ganancia del receptor), y el procesamiento de datos de RMN se realizó usando Topspin (versión 3.0, Bruker Biospin). Los espectros de RMN 1H unidimensionales se adquirieron utilizando pulsos de 30 °, tiempo de adquisición de 4 s, retraso de relajación de 1 s y puntos de datos de 32 K. Los puntos de datos se llenaron con ceros a 64 K y se multiplicaron con una función exponencial (ampliación de línea = 0,3 Hz) antes de la transformación de Fourier.

Los datos de los criterios de evaluación del ensayo de alimentación se presentan como medias ± desviación estándar, con n = 3 réplicas. Los datos de los estudios de bioactividad con células del músculo esquelético se presentan con diagramas de caja (n = 3 a 5 réplicas) para representar mejor la distribución de estos datos específicos. Todos los datos se distribuyeron normalmente con varianzas iguales (Tabla S7.1 a S7.3 en datos complementarios). El peso inicial de los peces en los diferentes grupos de dieta fue similar, lo que permitió un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para comparar los parámetros de crecimiento en diferentes momentos. También se realizó ANOVA unidireccional para todos los estudios de bioactividad con células del músculo esquelético. Cuando fue apropiado, las medias se compararon con el método de Tukey. La significancia estadística se probó con un nivel de probabilidad de 0,05. Todas las pruebas estadísticas se realizaron con GraphPad Prism (versión 9.2.0).

Los conjuntos de datos de expresión genética generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio DataverseNO para datos de investigación abiertos (https://doi.org/10.18710/MRVDNS), todos los demás datos se pueden encontrar en el material complementario o en el autor a pedido.

Aminoácido de cadena ramificada

hidrolizado de calanus

Hidrolizado de calanus crudo

Control

Hidrolizado de calanus desalado

Dimetilglicina

Hidrólisis enzimática de proteínas

Fracción 1 a 6 de hidrolizado de calanus

Relación de conversión alimenticia

cadena pesada de miosina

factor miogénico 5

Proteína 1a de determinación de mioblastos

Espectroscopia magnética de resonancia nuclear.

Relación de eficiencia proteica

Unidades de fluorescencia relativas

hidrolizado de salmón

hidrolizado de sardina

Cromatografía de exclusión por tamaño

Tasa de crecimiento específica

Hidrolizado de atún

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Este estudio fue apoyado por el proyecto del Consejo Noruego de Investigación “Beneficios de los productos proteicos de Calanus en piensos y alimentos” (número de subvención 312136), TailoTides (número de subvención 320086) y por el proyecto MABIT “Identificación y caracterización de péptidos promotores del crecimiento de Calanus ® Hidrolizado” (número de subvención UB0077). Los costos de publicación de este artículo han sido financiados por una subvención del fondo de publicaciones de UiT, la Universidad Ártica de Noruega. Un agradecimiento especial a Vibeke Voldvik y Nina Solberg de Nofima y a los ingenieros de SPAROS por su contribución al trabajo de laboratorio, manipulación de pescado, muestreo y análisis.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por UiT La Universidad Ártica de Noruega (incluido el Hospital Universitario del Norte de Noruega).

Facultad Noruega de Ciencias Pesqueras, UIT: Universidad Ártica de Noruega, apartado postal 6050, 9037, Tromsø, Noruega

Isak Bøgwald y Karl-Erik Eilertsen

Calanus AS, PO Box 808, 9258, Tromsø, Noruega

Isak Bøgwald y Alice Marie Pedersen

Nofima AS: Instituto Noruego de Investigación sobre Alimentación, Pesca y Acuicultura, Osloveien 1, 1430, Ås, Noruega

Tone-Kari K. Østbye, Sissel Beate Rønning y Sileshi Gizachew Wubshet

SPAROS Lda, Marim Business Area, Lote C, 8700-221, Olhão, Portugal

Jorge Días

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Cada autor contribuyó a diversas partes de la concepción y diseño del estudio; IB/JD/AMP/KEE para el ensayo de alimentación, e IB/SW/SBR/TKØ/AMP/KEE para los estudios de bioactividad. JD con ingenieros de SPAROS realizó la prueba de alimentación y TKØ/SW/SBR con ingenieros de Nofima realizaron los estudios de laboratorio de bioactividad. IB/SW/TKØ escribieron el primer borrador del manuscrito y todos los autores contribuyeron con la revisión, edición y finalización del manuscrito.

Correspondencia a Isak Bøgwald.

Isak Bøgwald es estudiante de doctorado industrial en UiT y Calanus AS, y Alice Marie Pedersen ocupa un puesto en Calanus AS. Tone-Kari K. Østbye, Sissel Beate Rønning, Jorge Dias, Karl-Erik Eilertsen y Sileshi Gizachew Wubshet declaran no tener relaciones comerciales o financieras que puedan interpretarse como un posible conflicto de intereses. Calanus AS adquirió financiación y SPAROS y Nofima realizaron ejecuciones prácticas de la prueba de alimentación y los estudios de laboratorio de bioactividad, respectivamente.

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Reimpresiones y permisos

Bøgwald, I., Østbye, TK.K., Pedersen, AM et al. El hidrolizado de Calanus finmarchicus mejora el rendimiento del crecimiento en ensayos de alimentación con juveniles de lubina europea y aumenta el crecimiento del músculo esquelético en estudios celulares. Informe científico 13, 12295 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38970-5

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Recibido: 14 de abril de 2023

Aceptado: 18 de julio de 2023

Publicado: 29 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38970-5

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