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Detección integral de toxicidad del agua del arroyo Pazarsuyu que contiene metales pesados ​​y papel protector del licopeno

Jun 03, 2023Jun 03, 2023

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 16615 (2022) Citar este artículo

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En este estudio, se investigó la contaminación por metales pesados ​​en el arroyo Pazarsuyu de la provincia de Giresun y el papel protector del licopeno contra la toxicidad causada por esta contaminación mediante la prueba Allium. Porcentaje de germinación, longitud de raíz y ganancia de peso como marcadores fisiológicos de toxicidad; índice mitótico (IM), micronúcleos (MN) y aberraciones cromosómicas (CA) como marcadores genéticos de toxicidad; Se utilizaron como marcadores anatómicos el nivel de malondialdehído (MDA), las actividades de superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT) como marcadores bioquímicos de toxicidad y los daños de las células meristemáticas. Para ello se dividieron bulbos de Allium cepa L. en seis grupos y se germinaron durante 72 h con dosis de licopeno de 215 mg/L y 430 mg/L, agua del grifo y agua de arroyo. La contaminación por metales pesados ​​se analizó con ICP-MS y se determinó Fe > Sr > Ba > Be > Mo > Li según la tasa de presencia en las muestras de agua de Pazarsuyu. Como resultado, los parámetros relacionados con la germinación y la proliferación de células meristemáticas de los bulbos germinados con muestras de agua de Pazarsuyu disminuyeron significativamente. El porcentaje de germinación, la longitud de la raíz y la ganancia de peso del grupo tratado con muestras de agua de Pazarsuyu disminuyeron un 50%, 73% y 68%, respectivamente, en comparación con el control. Además, las frecuencias de MN y CA, que indican los efectos genotóxicos, aumentaron y se detectaron anomalías significativas en los niveles de MDA, SOD y CAT, que indican el deterioro del equilibrio antioxidante/oxidante. La CA observada con alta frecuencia también fue confirmada por la fragmentación del ADN determinada por la prueba Comet. La aplicación de agua de corriente promovió daños anatómicos como daño a las células de la epidermis y la corteza, acumulación de algunas sustancias en las células de la corteza, núcleo celular aplanado y apariencia no aparente de tejido de conducción en las células meristemáticas de la punta de la raíz. Todas estas anomalías observadas en las células de la punta de la raíz de A. cepa se asociaron con la presencia de metales pesados ​​en las muestras de agua. La aplicación simultánea de licopeno con agua corriente redujo los efectos de los metales pesados ​​y dio como resultado una mejora dependiente de la dosis en todos los parámetros estudiados. La aplicación de licopeno mostró un papel protector al proporcionar un aumento en los parámetros de germinación y el IM, una disminución en las frecuencias de MN y CA y mejoras en las actividades de MDA, SOD y CAT. Como resultado, los metales pesados ​​detectados en las muestras de agua del arroyo Pazarsuyu causaron múltiples toxicidades en la planta bioindicadora, y el licopeno redujo esta toxicidad y registró un papel protector.

El cambio climático y la rápida industrialización provocan la reducción y la contaminación de los recursos hídricos. El agua es uno de los recursos renovables más importantes para la producción agrícola sostenible, el desarrollo económico y el bienestar general. También es uno de los recursos naturales mejor manejables debido a su capacidad de desviar, transportar, almacenar y reciclar. Los recursos hídricos superficiales y subterráneos son vitales en áreas como la agricultura, la energía hidroeléctrica, la ganadería, las actividades industriales, la silvicultura, la pesca, el mar y la recreación. A pesar de esta vital importancia, los ecosistemas de agua dulce del mundo constituyen sólo el 0,5% de la superficie terrestre, y dentro de este percentil, el río constituye el 0,01% y es de gran importancia1. Si bien la protección de los recursos de agua dulce es tan esencial para la humanidad, la contaminación de los cuerpos de agua naturales por microorganismos patógenos, sustancias radiactivas, desechos industriales y domésticos, sustancias orgánicas e inorgánicas como resultado de diversas actividades afecta negativamente la calidad del agua. Las consecuencias comunes de la contaminación del agua en los ecosistemas incluyen la muerte de especies, la pérdida de biodiversidad y la pérdida de servicios ecosistémicos. La principal causa de la contaminación del agua son los productos químicos vertidos en cuerpos de agua naturales como resultado de las actividades humanas. Los ejemplos más comunes de este tipo de contaminación son los iones de metales pesados ​​como el Hg de las actividades mineras, algunos compuestos nitrogenados utilizados en la agricultura, las moléculas orgánicas cloradas de las plantas de tratamiento de aguas residuales o de aguas residuales y los ácidos formados como resultado de diversas actividades productivas2.

Hoy en día, con el aumento de la población, la industrialización y los avances tecnológicos, diversos contaminantes llegan a los ambientes acuáticos y la contaminación ambiental aumenta día a día. Los metales pesados ​​ocupan un lugar importante entre estos contaminantes y constituyen uno de los tipos de contaminantes más peligrosos. Los metales pesados ​​con una larga vida media biológica, persistencia, no biodegradabilidad y potencial de bioacumulación en los tejidos de los organismos vivos pueden causar graves problemas de salud y pérdidas económicas. Los metales pesados ​​pueden dañar el sistema nervioso central, el sistema cardiovascular y el gastrointestinal. También pueden causar daño y pérdida de función en los pulmones, riñones, hígado, glándulas endocrinas y huesos3,4,5,6. En la literatura se han reportado los efectos tóxicos del consumo de recursos hídricos contaminados en la salud humana. Mohod y Dhote7 determinaron que enfermedades de los riñones, del sistema digestivo, del sistema circulatorio y del sistema nervioso pueden presentarse en humanos como resultado del consumo de agua potable que contiene metales pesados ​​en altas concentraciones. Las fuentes acuáticas contaminadas con metales pesados ​​provocan efectos tóxicos al acumularse en otros seres vivos además de los humanos. La acumulación de metales pesados ​​se observa en plantas de zonas agrícolas regadas con agua que contiene metales pesados ​​y en animales que pastan en dichas plantas contaminadas. Chatterjee y Chatterjee8 informaron que se producen reducciones en el crecimiento y efectos fitotóxicos como resultado de cambios en los procesos fisiológicos y bioquímicos en plantas cultivadas en áreas contaminadas con metales pesados. La protección de los recursos hídricos naturales y la garantía de su uso continuo para este fin se ha convertido en una cuestión cada vez más importante en Turkiye y en el resto del mundo. Por este motivo, los estudios sobre los recursos hídricos son especialmente importantes. En este estudio, se investigó la contaminación por metales en el arroyo Pazarsuyu, que es una importante fuente de agua, especialmente en aplicaciones agrícolas, y el perfil de toxicidad de esta contaminación.

Pazarsuyu es un arroyo ubicado al oeste del distrito de Bulancak de la provincia de Giresun (Turkiye). Su longitud es de 80 km, su cuenca de captación es de 874 km2, su caudal anual es de 674 hm3 y su caudal es de 21,4 m3/s. El arroyo toma su fuente de agua de las montañas Giresun en el sur. Hay 18 proyectos reguladores en total, incluidas las centrales hidroeléctricas (HPP) de Calıkobası, Oren, Gelen y Kovanlik activas en la corriente. Se informa que el arroyo está expuesto a aguas residuales domésticas de las ciudades de Bozat, Aydindere y Kovanlik y la mayoría de estas aguas residuales no son tratadas y se vierten directa o indirectamente en el arroyo Pazarsuyu. Además, el arroyo está expuesto a una intensa contaminación por pesticidas debido al cultivo de avellanas en esta región. Por esta razón, son frecuentes los informes en los medios de comunicación de que el cemento se mezcla con el arroyo de las construcciones de la CH, se producen muertes de peces, los árboles se secan y la contaminación en el arroyo Pazarsuyu ha recibido una gran reacción9,10. Debido al aumento de las industrias manufactureras y las prácticas agrícolas, Pazarsuyu se enfrenta a diversos problemas ambientales. Los estudios que investigan la contaminación en el arroyo Pazarsuyu aún no alcanzan el nivel deseado y no hay ningún estudio que examine los efectos sobre los organismos. En este estudio se investigó tanto la contaminación por metales pesados ​​en el arroyo como los efectos tóxicos de esta contaminación sobre Allium cepa, un bioindicador. Además, dentro del alcance del estudio se investigaron los efectos de la aplicación de licopeno como solución para reducir los efectos tóxicos.

En estudios recientes se han utilizado extractos obtenidos de plantas para reducir la toxicidad provocada por los metales pesados. El licopeno es un carotenoide natural sintetizado por las plantas. Además de dar color a frutas y verduras, absorbe la luz durante la fotosíntesis y protege a las plantas de condiciones de estrés. El licopeno es un antioxidante eficaz que desempeña un papel en la eliminación de los radicales libres. Debido a la naturaleza lipófila de los carotenoides, el licopeno se encuentra principalmente en las membranas celulares y en los componentes lipoproteicos. El licopeno exhibe la capacidad de interrumpir la autooxidación de los lípidos al apagar los radicales peroxilo de los lípidos mediante transferencia de electrones, eliminación de hidrógeno o adición11. En muchos estudios de la literatura, la propiedad protectora del licopeno se ha asociado con sus propiedades antioxidantes. Hedayati et al.12 informaron que el licopeno actúa como un antioxidante potencial, previniendo la toxicidad inducida por metales pesados ​​al reducir el estrés oxidativo. Çavuşoğlu et al.13 informaron que la administración de licopeno protegía contra la citotoxicidad inducida por mercurio y reducía los efectos genotóxicos. El nacimiento de la vida fue con agua, y también puede terminar con sed. Por esta razón, los científicos deberían llamar la atención sobre la contaminación del agua y mantenerla en la agenda mediante la realización de estudios sobre el control, la protección y la sostenibilidad de los recursos hídricos. Hay muchos estudios sobre los recursos hídricos naturales en la literatura. En estos estudios se investiga la contaminación en la fuente de agua, la eliminación de la contaminación o sus efectos tóxicos. Los estudios existentes sobre Pazarsuyu son en su mayoría estudios sobre el nivel de contaminación. En este estudio, se investigaron la contaminación por metales pesados ​​en el agua de los arroyos, los efectos tóxicos de esta contaminación en un organismo bioindicador y los efectos de la aplicación de licopeno como solución para reducir esta toxicidad. Se investigaron los efectos tóxicos y las propiedades protectoras desde el punto de vista fisiológico, bioquímico, citogenético y anatómico y se reveló un perfil completo.

Este estudio se llevó a cabo con muestras recolectadas del arroyo Pazarsuyu en el distrito de Bulancak de la provincia de Giresun en la región del Mar Negro. A lo largo del arroyo hay centrales hidroeléctricas y en sus alrededores se cultiva avellana, que es la mayor fuente de ingresos del distrito. Se recolectaron muestras de agua el 29 de marzo de 2021. Se tomaron muestras de agua desde una distancia de 100 m antes de que el arroyo Pazarsuyu llegue al Mar Negro (Fig. 1). Se recogieron muestras de diferentes profundidades del mismo lugar en frascos estériles de 250 ml. Se tomaron un total de 10 muestras de agua y se realizaron análisis de metales pesados.

Estación de recogida de muestras. El mapa se creó utilizando mapas.yandex.com, 2021. Las coordenadas del área de recolección de muestras (área principal: 40° 56′ 39.0″ N, 38°10′ 29.5E) se ingresaron en mapas Yandex e imágenes satelitales del área de investigación. se obtuvieron.

Las muestras de agua recolectadas se filtraron usando un filtro de membrana de 0,45 µm (Whatman Merck Millipore Corporation). Las muestras de agua filtrada se diluyeron hasta un volumen de 10 ml con HNO3 al 3 % para su análisis. Las concentraciones de metales pesados ​​en las muestras se midieron mediante espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (Bruker 820-MS ICP-MS). Todas las mediciones se realizaron en tres réplicas14. Las tasas de recuperación de metales en el material de referencia oscilaron entre 90,7 y 104,4%.

Se utilizaron bulbos de A. cepa de tamaño casi igual como material de prueba y licopeno (extracto de licopeno de Sepe Natural: 90 cápsulas × 430 mg) como material biológico protector. Los bulbos se dividen en 6 grupos (Tabla 1).

Los bulbos de todos los grupos se colocaron en vasos de vidrio preesterilizados con un diámetro de 85 × 100 ml. Los bulbos del grupo de control se germinaron con agua del grifo y los bulbos del grupo de tratamiento se germinaron con agua de arroyo y dosis de licopeno de 215 mg/L y 430 mg/L. La germinación se realizó a temperatura ambiente durante 72 h. Durante la germinación se realizaron controles diarios de los bulbos y adiciones de solución cuando fue necesario. Al cabo de 72 h, los bulbos fueron lavados con agua destilada y preparados para análisis fisiológicos, genéticos, bioquímicos y anatómicos15. Para determinar la toxicidad de las muestras se utilizaron diferentes parámetros y los parámetros analizados se dan en la Fig. 2.

Diseño experimental del estudio.

La investigación experimental con muestras de agua y plantas, incluida la recolección de muestras de agua y el suministro de material vegetal, cumple con las directrices y la legislación institucional, nacional e internacional.

Los efectos de los iones de metales pesados ​​en el agua del arroyo Pazarsuyu y el licopeno sobre el crecimiento de las raíces de A. cepa se determinaron midiendo las puntas de las raíces con una regla milimétrica, y sus efectos sobre el aumento de peso se determinaron midiendo el peso de los bulbos con una balanza de precisión antes y después. después de la aplicación. Los efectos sobre el porcentaje de germinación se determinaron con la ayuda de la Ec. (1) 16.

Para detectar anomalías cromosómicas (CA) y la presencia de micronúcleos (MN), las puntas de las raíces de los bulbos en germinación se cortaron a 1 cm y se mantuvieron en solución de Clarke (3 volúmenes de alcohol etílico - 1 volumen de ácido acético glacial) durante 2 h, se lavó en alcohol etílico (96%) durante 15 min y se conservó en refrigeración a +4 °C en alcohol etílico (%70). Para la preparación permanente, las puntas de las raíces se hidrolizaron en ácido clorhídrico 1 N durante 17 min en una estufa a 60 °C y se mantuvieron en ácido acético (45%) durante 30 min al final del período. Posteriormente, las puntas de las raíces se tiñeron con acetocarmín durante 24 h, se trituraron con ácido acético (45%) y se examinaron bajo el microscopio de investigación modelo IRMECO IM-450 TI, y se fotografió la presencia de CA y MN con un aumento de × 50017. Para determinar la presencia de NM se utilizaron los criterios propuestos por Fenech et al.18. Según estos criterios, para que una formación sea MN; El diámetro debe ser 1/3 del diámetro nuclear, de forma redonda u ovalada y claramente distinguible del núcleo. El índice mitótico (IM), que muestra la proporción de células que entran en mitosis con respecto al total de células, se calculó con la ayuda de la ecuación. (2).

Para la electroforesis en gel unicelular alcalino se aplicó el protocolo propuesto por Chakraborty et al.19. Los cometas se analizaron con el software de ensayo Comet (CASP) versión 1.2.3b20 con los parámetros de longitud del ADN de la cola. Se analizaron un total de 2000 células para cada grupo, 200 en cada bulbo, para detectar daños en el ADN. La extensión del daño al ADN se calificó de 0 a 4 dependiendo del nivel de daño al ADN. Las células se clasificaron en cinco categorías según la longitud del ADN de la cola, que oscilaba entre cero y cuatro, según Collins21. El daño total al ADN por grupo, expresado como unidades arbitrarias, se calculó utilizando la ecuación. (3).

(i: grado de daño (0, 1, 2, 3, 4), Ni: el número de células en i grado).

Las mediciones de MDA se realizaron según el método propuesto por Unyayar et al.22. Se homogeneizaron 0,5 g de punta de raíz en 1 ml de solución de ácido tricloroacético (TCA-5%). El homogeneizado se transfirió a un tubo nuevo y se centrifugó durante 10 minutos a 12.000 g a 24 °C. Se transfirieron volúmenes iguales de ácido tiobarbitúrico (TBA-0,5%) y sobrenadante a un tubo nuevo, se incubaron en solución de TCA (20%) a 96 °C durante 30 min, luego se colocaron en un baño de hielo y se centrifugaron a 10.000 g durante 5 min. . La absorbancia del sobrenadante se midió a 532 nm y el nivel de MDA se expresó como µM/g FW.

La extracción enzimática se realizó a 4 °C sobre una muestra de 0,5 g de puntas de raíces frescas, lavadas con agua destilada y homogeneizadas en 5 mL de tampón NaH2PO4 (50 mM, pH 7,8). La mezcla se centrifugó a 10.500 g durante 20 min y el sobrenadante se utilizó para análisis enzimático23.

La medición de la actividad de SOD se realizó según el método propuesto por Beauchamp y Fridovich24. La solución de reacción se preparó usando 1,5 ml de tampón NaH2PO4, 0,3 ml de C5H11NO2S, 0,3 ml de nitroazul de cloruro de tetrazolio, 0,3 ml de EDTA-Na2, 0,3 ml de C17H2ON4O6, 0,01 ml de extracto enzimático, 0,01 ml de polivinilpirrolidona insoluble y 0,28 ml de agua desionizada. La reacción se inició colocando los tubos bajo lámparas fluorescentes de 15 W durante 10 min y finalizó manteniendo los tubos en la oscuridad durante 10 min. La absorbancia se leyó a 560 nm y la actividad de SOD se expresó como U/mg de FW23.

La medición de la actividad CAT se realizó según el método propuesto por Beers y Sizer25. La actividad CAT se midió en 2,8 ml de solución de reacción que contenía 0,3 ml de peróxido de hidrógeno 0,1 M, 1,0 ml de agua destilada y 1,5 ml de tampón NaH2PO4 200 mM utilizando un espectrofotómetro UV-VIS. La reacción se inició añadiendo 0,2 mL de extracto enzimático; La actividad CAT se midió monitorizando la disminución de la absorbancia a 240 nm como resultado del consumo de peróxido de hidrógeno y se expresó como DO240 nm min/g23.

Las puntas de las raíces se lavaron con agua destilada y posteriormente se colocaron en material de espuma y se tomaron sus secciones transversales con ayuda de una navaja de afeitar afilada. Las secciones se tiñeron con azul de metileno (5%) durante 2 min. Los daños y cambios anatómicos se investigaron en secciones transversales utilizando el microscopio de investigación modelo IRMECO IM-450 TI y se fotografiaron con un aumento de × 20026.

Para determinar los efectos de recuperación (RE) del licopeno, se utilizaron los datos de los grupos a los que se aplicó licopeno, los datos del grupo de aplicación de agua de arroyo y los datos del grupo de control. La RE del licopeno se calculó utilizando la siguiente ecuación. (4).

D1: datos del grupo aplicado de 215 mg/L de licopeno o 430 mg/L de licopeno, D2: datos del grupo tratado con agua de arroyo, D3: datos del grupo de control.

Los datos obtenidos se evaluaron utilizando el programa del paquete SPSS Statistics 22 (IBM SPSS, Turkiye). Los datos se muestran como desviación estándar media (DE). La significación estadística entre las medias se determinó con la ayuda del análisis de varianza unidireccional (ANOVA unidireccional) y las pruebas de Duncan, y se consideró estadísticamente significativa cuando el valor de p determinado fue inferior a 0,05.

Además, se realizó un análisis de correlación de Pearson (bilateral) en RStudio y gráficos de correlación con el paquete corrplot27. Se realizó un análisis de componentes principales (PCA) para parámetros fisiológicos, genéticos y bioquímicos, que son diferentes biomarcadores de toxicidad para cada dosis probada. Se utilizaron los paquetes FactoMineR28 y factoextra29 en RStudio para realizar el análisis de componentes principales (PCA)30.

Las concentraciones de metales pesados ​​en muestras de agua recolectadas del arroyo Pazarsuyu se muestran en la Tabla 2. Como resultado del análisis, se detectó Fe en altas concentraciones en las muestras de agua, mientras que se detectó la presencia de Cd metal en la concentración más baja. Entre estos metales, Sr, Ba, Be, Mo, Li, Te y Ti no se encuentran entre los elementos cuyos valores límite figuran en el "Reglamento sobre el agua destinada al consumo humano" publicado por el Ministerio de Salud de la República de Turkiye. Las concentraciones de otros metales pesados ​​se ajustan a los valores especificados en el reglamento. Las principales causas de esta contaminación por metales pesados ​​en el arroyo Pazarsuyu son los pesticidas procedentes del cultivo de avellanas en las zonas agrícolas circundantes al arroyo, las centrales eléctricas instaladas en el arroyo y los establecimientos industriales situados cerca del arroyo31. En la literatura existen estudios sobre la contaminación del agua por iones de metales pesados ​​como consecuencia de las actividades de establecimientos industriales ubicados cerca de recursos hídricos naturales. Vitek et al.32 investigaron el alcance de la contaminación por metales pesados ​​en el ecosistema acuático del río Loučka en la República Checa e informaron que los metales pesados ​​Ni y Cr eran más altos en el agua del río. En la literatura se ha investigado la contaminación por metales pesados ​​en diferentes recursos hídricos del mundo y se han obtenido importantes resultados. Moore et al.33 investigaron la contaminación por metales pesados ​​en las muestras de agua y sedimentos de los arroyos en la región de Sungun y observaron que las concentraciones de Cu, Mo, Pb, Zn y Ni excedían las concentraciones máximas permitidas en la legislación internacional. Wasiu et al.34 detectaron metales Cu, Zn, Fe, Cd, Pb y As en los ríos del estado de Osun, Nigeria, e informaron que sus tasas de presencia estaban por encima de los límites establecidos por las normas de calidad del agua potable de la OMS y Nigeria.

Los cambios fisiológicos en A. cepa causados ​​por la contaminación por metales pesados ​​en el arroyo Pazarsuyu se muestran en el Cuadro 3. La mayor germinación, longitud de raíces y ganancia de peso se midieron en el grupo control (Grupo I) y en los Grupos II y III, que estuvieron expuestos a dos diferentes dosis de licopeno. No se observaron diferencias estadísticas en términos de porcentaje de germinación, longitud de raíz y ganancia de peso en el grupo control y en los grupos a los que se aplicó sólo licopeno (p > 0,05). Este resultado muestra que la aplicación de licopeno por sí sola no causó ninguna anomalía en los parámetros relacionados con la germinación. La aplicación de agua de arroyo provocó una disminución en todos los parámetros fisiológicos investigados. En comparación con el Grupo I (control), el porcentaje de germinación disminuyó a la mitad (50%), la longitud de la raíz aproximadamente 3.64 veces (73%) y el peso aproximadamente 3.06 veces (68%) en el Grupo IV tratado con agua de arroyo. Se encontró que estas disminuciones eran estadísticamente significativas (p < 0,05). En el Grupo V y Grupo VI, en los que se aplicaron juntos agua del arroyo y licopeno, el licopeno disminuyó los efectos de los metales pesados ​​en el agua del arroyo y nuevamente causó aumentos estadísticamente significativos (p <0,05) en los valores de los parámetros fisiológicos investigados. Se observó que estos aumentos observados fueron más pronunciados con la dosis de licopeno de 430 mg/l. En comparación con el Grupo IV tratado con agua de arroyo, el porcentaje de germinación aumentó en un 25%, la longitud de la raíz en 2 veces (100%) y el peso en aproximadamente 1,97 veces (98%) en el Grupo VI tratado con una dosis de 430 mg/L de licopeno.

El hecho de que la aplicación de agua de arroyo provoque una disminución en los parámetros relacionados con la germinación en A. cepa puede estar asociado con la contaminación por metales pesados. Las disminuciones observadas en el alargamiento de las raíces y el aumento de peso en el grupo al que se aplicó agua de arroyo pueden explicarse por la reducción de la absorción de agua y nutrientes de las raíces por parte de los iones de metales pesados. Se ha informado en la literatura que en presencia de metales pesados, se inhibe la absorción de agua y minerales por las raíces, se altera la fotosíntesis y el metabolismo del nitrógeno y se reduce el crecimiento de raíces y brotes. La producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) se ha demostrado como la principal causa de estos efectos negativos provocados por la toxicidad de metales pesados ​​en las plantas35. De manera similar, Doğan et al.36 determinaron que la contaminación por metales pesados ​​en el agua del arroyo Civil (Ordu-Turquía) causaba estrés oxidativo en A. cepa, lo que resultaba en reducciones significativas en el porcentaje de germinación, la longitud de las raíces y el aumento de peso. En otro estudio se determinó que muestras de agua del río Melet (Ordu, Turquía) que contenían metales pesados ​​como Pb, Al, Ni, Cr y Fe limitaban el crecimiento y desarrollo de V. faba37.

Los efectos genotóxicos del agua de los arroyos y las propiedades protectoras del licopeno se determinaron investigando las proporciones de MI y las frecuencias de MN y CA. Los efectos del agua de la corriente en la división del número de células y el MI se muestran en la Fig. 3. Se determinaron tasas de MI similares en los grupos de control y tratados solo con licopeno. El número de células en división en el Grupo IV tratado con agua de corriente disminuyó en un 43,6% en comparación con el grupo de control. La aplicación de agua de arroyo promovió la genotoxicidad en las células de la punta de la raíz, provocando un aumento en las frecuencias de MN y CA (Tabla 4). Si bien no se observó formación de MN en los grupos de control y solo se aplicó licopeno, el MN se determinó con una frecuencia de 74,1 ± 7,12 en el grupo al que se aplicó agua del arroyo. El aumento en la frecuencia de MN fue estadísticamente significativo (p <0,05). Además, la aplicación de agua corriente indujo CA como fragmento, cromosoma pegajoso, cromosoma vagabundo, distribución desigual de cromatina, puente, mitosis irregular y anafase multipolar (Fig. 4). El mayor efecto de los metales pesados ​​en el agua de los arroyos sobre los cromosomas se observó en forma de formación de fragmentos. La aplicación de licopeno junto con agua de arroyo redujo el efecto de los metales pesados ​​en el agua y provocó una mejora en los indicadores de genotoxicidad investigados. Se observó que esta mejora era más pronunciada con la dosis de licopeno de 430 mg/l. En comparación con el Grupo IV, el número de MN disminuyó aproximadamente 1,60 veces (38%) y el IM aumentó aproximadamente 1,23 veces (1,04%) en el Grupo VI, donde se administró una dosis de 430 mg/L de licopeno junto con agua de arroyo.

Efectos de los tratamientos con agua de arroyo y licopeno sobre el número de células divisorias (DCN) y el índice mitótico (MI). El IM se calculó contando 10.000 células en cada grupo. *Indica la diferencia estadística entre los Grupos I y IV, **indica la diferencia estadística entre los Grupos IV y VI (p < 0,05).

CA inducidas por iones de metales pesados ​​en el agua de los arroyos. MN (a), fragmento (b), cromosoma pegajoso (c), cromosoma vagabundo (d), distribución desigual de la cromatina (e), puente (f), mitosis desordenada (g), anafase multipolar (h).

La razón principal de la genotoxicidad inducida por el agua de los arroyos puede explicarse por la interacción directa o indirecta de los metales pesados ​​en el agua de los arroyos con los cromosomas de las células de la punta de la raíz. Se ha informado en la literatura que los metales pesados ​​causan daños graves al ADN al reaccionar con el ADN (directamente) o al producir ROS (indirectamente). También se ha informado que la exposición a metales pesados ​​provoca alteraciones en la integridad del genoma. La inhibición en los mecanismos de reparación del ADN, roturas de doble cadena, MN, roturas, cambios de cromátidas hermanas y variaciones en genes son daños importantes causados ​​por metales pesados ​​en los cromosomas38. Algunos estudios también informan sobre los efectos genotóxicos de las aguas de los arroyos que contienen contaminación por metales pesados. Türkmen et al.39 informaron aumentos significativos en la frecuencia de CA y MN y disminuciones significativas en IM en células de la punta de la raíz de A. cepa expuestas al agua del arroyo Melet (Ordu-Turquía) contaminada con Pb, Fe, Al, Ni, Cu, Zn, Cr. y iones Cd. Doğan et al.36 informaron que la aplicación de agua de arroyo que contiene metales pesados ​​reduce la proliferación celular y causa efectos genotóxicos en A. cepa.

La genotoxicidad causada por el agua de los arroyos contaminada con metales pesados ​​también fue respaldada por la técnica del "ensayo Comet" utilizada para detectar daños en el ADN y su cantidad a nivel celular. En este contexto, los efectos de los tratamientos con agua de arroyo y licopeno sobre el ADN en las células de la punta de la raíz de A. cepa se muestran en la Fig. 5. Los hallazgos de los Grupos II y III mostraron que la administración de licopeno por sí sola no hizo una diferencia significativa en el daño del ADN en comparación con el control (p > 0,05). Sin embargo, la exposición al agua de la corriente causó daño estadísticamente significativo (p <0,05) en el ADN de las células de la punta de la raíz de A. cepa. Mientras que la puntuación media de daño al ADN fue de 11,33 ± 0,72 en el grupo de control (Grupo I), hubo un fuerte aumento en el Grupo IV con agua corriente sola y la puntuación media de daño al ADN fue de 215,17 ± 8,91. En el grupo V, donde se administraron juntos agua de arroyo y 215 mg/l de licopeno, la puntuación de daño al ADN disminuyó a 172,67 ± 12,89. En el Grupo VI, donde se administraron 430 mg/L de licopeno junto con agua del arroyo, la puntuación de daño al ADN disminuyó aún más a 139,67 ± 13,03. El aumento en la puntuación de daño al ADN debido a la exposición al agua de los arroyos indica que los iones de metales pesados ​​en el agua de los arroyos inducen roturas de la doble hebra del ADN en las células de la punta de la raíz de A. cepa. Por otro lado, se determinó que hubo una diferencia estadísticamente significativa (p < 0.05) entre los puntajes de daño al ADN determinados en el Grupo IV expuesto al agua de arroyo y en los grupos (Grupo V y VI) tratados con licopeno junto con agua de arroyo. La prueba Comet es una prueba fiable que se utiliza para detectar roturas de una sola cadena de ADN en todos los tipos de células. En la prueba del cometa, el ADN dañado muestra una estructura de "cometa" en la electroforesis, y el porcentaje de ADN en la cola es directamente proporcional al daño40. La alta puntuación de daño al ADN en el grupo aplicado con agua corriente indica fragmentación del ADN y roturas de la cadena de ADN. Estos daños también confirman el efecto genotóxico detectado por las pruebas de MN y CA. De manera similar, Scalon et al.41 investigaron el efecto genotóxico de la aplicación de agua de corriente contaminada con metales pesados ​​como resultado de descargas industriales con la prueba del cometa en Hyphessobrycon luetkenii (Boulenger) e informaron que muestras de agua que contenían metales pesados ​​tenían un efecto genotóxico al causar daños en el ADN. fragmentación.

Efectos de la aplicación de agua de arroyo y licopeno sobre el ADN de las células meristemáticas de la raíz de A. cepa. Grupo I: control, Grupo II: 215 mg/L de licopeno, Grupo III: 430 mg/L de licopeno, Grupo IV: agua de arroyo, Grupo V: agua de arroyo + 215 mg/L de licopeno, Grupo VI: agua de arroyo + 430 mg/ L licopeno. 0: sin daño, 1: daño bajo, 2: daño moderado, 3: daño alto, 4: daño extremo. Los datos se dan como media ± SEM. Las medias mostradas con letras diferentes (a–d) en el gráfico son significativas en p < 0,05.

Los efectos del agua de corriente contaminada con metales pesados ​​sobre los parámetros bioquímicos se muestran en la Tabla 5. No hubo diferencias estadísticamente significativas (p > 0,05) entre el grupo de control y los grupos de licopeno solo en términos de los parámetros analizados. Se observaron cambios significativos en los niveles de MDA, SOD y CAT en el grupo aplicado al agua del arroyo. En comparación con el grupo de control, el nivel de MDA aumentó aproximadamente 2,90 veces, la actividad de SOD 2,84 veces y la actividad de CAT 2,68 veces en el Grupo IV tratado con agua de corriente. La administración conjunta de agua corriente y licopeno redujo los efectos de los metales pesados ​​y provocó una disminución en los niveles de los parámetros bioquímicos investigados. Se observó que esta disminución fue más pronunciada con la dosis de licopeno de 430 mg/l. En el Grupo VI tratado con 430 mg/L de licopeno, el nivel de MDA disminuyó aproximadamente 1,82 veces, la actividad de SOD 1,43 veces y la actividad de CAT 1,39 veces en comparación con el Grupo IV tratado con agua de arroyo.

Los aumentos en los niveles de MDA, SOD y CAT en las células de la punta de la raíz indican que se induce estrés oxidativo en la célula. Especialmente considerando que el MDA es un producto de peroxidación, se puede decir que la aplicación de agua corriente provoca peroxidación lipídica. MDA es un producto bien conocido de la peroxidación lipídica y se utiliza como marcador de daño a la membrana celular. El aumento del estrés oxidativo en la célula provoca la peroxidación de los lípidos de la membrana celular y aumenta el nivel de MDA en la célula42. El aumento de los niveles de MDA en las raíces de A. cepa expuestas al agua de los ríos del Grupo IV puede explicarse por el estrés oxidativo inducido por los metales pesados ​​en el agua y el daño a la membrana celular. El aumento del estrés oxidativo en las células es neutralizado por antioxidantes endógenos. SOD y CAT son enzimas antioxidantes que inhiben la formación de radicales libres en las células o reducen sus efectos. Mientras que la SOD neutraliza el radical superóxido en la célula, el CAT actúa sobre el peróxido de hidrógeno y cataliza su conversión en moléculas inofensivas como el agua y el oxígeno35. Cuando se evalúa en este contexto, el aumento de los niveles de SOD y CAT en las células madre expuestas al agua de río puede explicarse por el hecho de que los metales pesados ​​en el agua promueven el estrés oxidativo en la célula y aumentan los niveles de SOD y CAT de la célula. Estos resultados también son consistentes con los resultados de algunos estudios que investigan la toxicidad bioquímica inducida por metales pesados ​​en el agua. Türkmen et al.39 informaron que el agua de los arroyos contaminada con aguas residuales de petróleo y que contenía metales pesados ​​aumentó los niveles de MDA en las raíces en el material de prueba de A. cepa y causó daño oxidativo. Aljahdali y Alhassan43 afirmaron que las muestras de sedimentos y agua que contenían contaminación por metales pesados ​​por encima de los valores límite aumentaron significativamente las actividades de las enzimas CAT, SOD y glutatión S-transferasa en C. serrulata.

Los daños anatómicos causados ​​por metales pesados ​​en el agua de los arroyos se muestran en la Fig. 6. No se observó daño en las células meristemáticas de la punta de la raíz del grupo de control, Grupo II y III tratados solo con licopeno. La aplicación de agua de corriente en el Grupo IV indujo daños anatómicos como daño a las células de la epidermis y la corteza, acumulación de algunas sustancias en las células de la corteza, núcleo celular aplanado y apariencia poco clara del tejido de conducción en las células del meristemo de la punta de la raíz. La aplicación de licopeno junto con agua de arroyo disminuyó los efectos negativos de los metales pesados ​​sobre las células de la raíz y provocó una disminución en la severidad del daño a las células meristemáticas (Cuadro 6). Se determinó que estas disminuciones fueron más pronunciadas con la dosis de licopeno de 430 mg/l.

Daños en las células meristemáticas causados ​​por metales pesados ​​en el agua de los arroyos. Aspecto normal de las células de la epidermis (a), aspecto normal de las células de la corteza (b), aspecto normal del núcleo celular ovalado (c), aspecto normal del tejido vascular (d), daño de las células de la epidermis (e), daño de las células de la corteza: blanco flecha, acumulación de algunas sustancias en las células de la corteza: flecha negra (f), núcleo celular aplanado (g), tejido vascular poco claro (h).

Se cree que estos daños anatómicos, especialmente el daño a las células de la epidermis-corteza y el daño al núcleo de las células aplanadas causado por metales pesados, ocurren como resultado de los mecanismos de defensa desarrollados por la planta contra los metales pesados. Porque, en exámenes microscópicos, se observó que las raíces expuestas a metales pesados ​​en el agua de los arroyos aumentaban el número y el orden de las células de la epidermis y de la corteza para no absorber metales pesados ​​en las células. Estos cambios pueden aumentar el contacto de las células de la epidermis y la corteza entre sí, provocando su supresión y por tanto deformidades en las formas y núcleos de las células. La información incluida en la literatura respalda nuestra opinión de que las plantas expuestas a metales pesados ​​pueden desarrollar diversos mecanismos de defensa físicos y químicos, como acumular, almacenar y cristalizar metales, formar cambios estructurales en la membrana y pared celular, aumentar el número de vacuolas y metales. -síntesis de proteínas de unión44. Estudios similares en la literatura respaldan nuestros hallazgos. Doğan et al.36 observaron que el agua del arroyo Civil (Ordu-Turkiye) contaminada con metales pesados ​​Cr, Co, Ni, Cu, Cd, Pb y Fe causaba daños anatómicos como necrosis, engrosamiento de la pared celular de la corteza, deformación celular y acumulación. de algunas sustancias en las células de la corteza, núcleo celular aplanado y tejido vascular poco claro en las células meristemáticas de la punta de la raíz de A. cepa.

El análisis de correlación de todos los parámetros se muestra en la Fig. 7a. Las correlaciones positivas se muestran en azul y las correlaciones negativas se muestran en rojo. La intensidad del color y el tamaño del círculo son proporcionales a los coeficientes de correlación. El aumento de peso, la longitud de la raíz y los parámetros MI mostraron correlaciones negativas con las actividades CAT y SOD, el nivel de MDA, la puntuación de daño al ADN, la frecuencia de formación de MN y las formaciones de CA. Los datos de correlación obtenidos mostraron que los parámetros investigados tenían efectos positivos o negativos significativos entre sí. Los efectos fisiológicos, bioquímicos y genéticos generales de las administraciones de agua corriente y licopeno, así como la agrupación entre biomarcadores después del tiempo de aplicación, se visualizaron mediante el análisis de componentes principales (PCA) y se muestran en las figuras 7b-d. En la Fig. 7b, que trata de los análisis PCA de parámetros fisiológicos y bioquímicos, las dos primeras dimensiones del biplot explicaron el 94,0% de la varianza general, y el primer eje (dim1) distinguió claramente los grupos de control y aplicación (90,3%). El dim2 como ayuda de visualización representó el 3,7% de la variación total. Como resultado del análisis, se encontró que el nivel de MDA, las actividades de SOD y CAT estaban cercanas entre sí, con un componente muy positivo en el eje dim1, y los parámetros de ganancia de peso y longitud de la raíz son un componente muy negativo en el eje dim1. Los análisis de PCA de parámetros fisiológicos y genéticos se muestran en la Fig. 7c. En el biplot, las dos primeras dimensiones, el primer eje (dim1) 94,8% y el segundo eje (dim2) 2,6%, explican el 97,4% de la varianza general. Como resultado del análisis, se encontró que la puntuación de daño del ADN, los niveles de formación de MN y CA estaban cerca entre sí, con un componente muy positivo en el eje dim1 y un ligero positivo en el eje dim2. La Figura 7d muestra análisis PCA de parámetros genéticos y bioquímicos. Las dos primeras dimensiones del biplot, el primer eje (dim1) 95,1% y el segundo eje (dim2) 2,6%, explican el 97,7% de la variación total. Como resultado de la evaluación, se encontró que la frecuencia de MN, la puntuación de daño del ADN, la formación de CA, el nivel de MDA, las actividades de CAT y SOD eran componentes muy positivos en el eje dim1. Todos estos análisis de PCA confirman las interrelaciones de todos los parámetros fisiológicos, genéticos y bioquímicos investigados.

Correlación y análisis de componentes principales (PCA) de parámetros de respuesta fisiológica, bioquímica y genética. Correlación de parámetros fisiológicos, bioquímicos y genéticos (a), análisis PCA de parámetros fisiológicos y parámetros bioquímicos (b), análisis PCA de parámetros fisiológicos y parámetros genéticos (c), análisis PCA de parámetros genéticos y bioquímicos (d). Aumento de peso de WG, longitud de raíz de RL, daño al ADN DNA-Dam. El análisis de correlación de Pearson (bilateral) se realizó y visualizó con el software Rstudio. Las correlaciones positivas se muestran en azul y las negativas en rojo. La intensidad del color y el tamaño del círculo son proporcionales a los coeficientes de correlación.

El tratamiento con agua de arroyo indujo la formación de MN y CA en las células de la punta de la raíz de A. cepa, y la aplicación de licopeno mostró un papel protector al reducir la frecuencia de estas anomalías (Fig. 8). El papel protector del licopeno frente al efecto genotóxico aumentó según la dosis. La administración de 215 mg/l de licopeno proporcionó protección contra MN y CA en el rango de 17,1 a 53,7 %. En la aplicación de 430 mg/L de licopeno se obtuvo una protección entre 37,3 y 90,7%. La mayor protección se observó contra formaciones de anafase multipolar con ambas dosis.

Efectos de recuperación de las dosis de licopeno frente a las frecuencias de MN y CA.

En los últimos años se han utilizado extractos de plantas como caroteno, semilla de uva, Ginkgo biloba L., café verde y té verde para reducir la toxicidad causada por contaminantes ambientales como iones de metales pesados ​​y pesticidas. En este estudio se utilizó el licopeno, un poderoso antioxidante, para reducir los efectos de toxicidad fisiológica, genética, bioquímica y anatómica causada por la contaminación por metales pesados ​​en el arroyo Pazarsuyu. Debido a sus propiedades antioxidantes, el licopeno redujo los efectos tóxicos de los iones de metales pesados ​​en el agua de los arroyos y mejoró los parámetros fisiológicos, genéticos, bioquímicos y anatómicos. Este papel curativo del licopeno se ha asociado con la neutralización del estrés oxidativo inducido por metales pesados ​​en el agua de los arroyos. El licopeno protege a la célula contra el estrés oxidativo neutralizando los radicales libres mediante diferentes mecanismos como la formación de aductos, la transferencia de electrones al radical y la abstracción de hidrógeno alílico. Y también el licopeno tiene un efecto eliminador del oxígeno singlete y de los radicales peroxilo formados por agentes tóxicos en la célula45. La característica protectora del licopeno contra los efectos multitóxicos causados ​​por el agua del arroyo Pazarsuyu que contiene metales pesados ​​se debe a estas actividades. La característica protectora del licopeno, que detectamos en este estudio, también ha sido demostrada por muchos estudios. Çavuşoğlu et al.46 informaron que el licopeno proporciona una protección significativa contra la toxicidad fisiológica, bioquímica y genética inducida por Pb, Zn, Fe, Cu, Ni, Cd y Hg. Kalefetoğlu Macar et al.47 informaron que el licopeno proporciona protección dosis dependiente contra el daño genotóxico y anatómico causado por el ion de metal pesado Co en una dosis de 5,5 mg/L en raíces de A. cepa.

El arroyo Pazarsuyu, que se encuentra en el distrito de Bulancak de la provincia de Giresun y llega al Mar Negro, es una importante fuente de agua en la región y se utiliza para muchos propósitos, especialmente para aplicaciones agrícolas. En este estudio se determinó que existe contaminación por metales pesados ​​en el arroyo Pazarsuyu por encima de los valores límite especificados en la legislación nacional e internacional. El alcance de la contaminación del agua no solo se determinó mediante métodos basados ​​en mediciones, sino que también se investigaron en todos los aspectos los efectos biológicos de la contaminación en A. cepa, que es el material de prueba indicador. Las muestras de agua recolectadas del arroyo causaron toxicidad al promover cambios en los rasgos fisiológicos, genéticos y bioquímicos, así como en la estructura anatómica del material de prueba de A. cepa. La aplicación de licopeno junto con agua corriente redujo los efectos nocivos de los metales pesados ​​y nuevamente provocó una mejora significativa en todos los parámetros investigados. Se determinó que esta mejora era aún más pronunciada cuando se aplicaba una dosis de licopeno de 430 mg/l. El mal uso de los recursos hídricos, el calentamiento global y la contaminación de los recursos hídricos naturales indican que habrá una crisis del agua en el mundo del futuro. Los recursos hídricos vitales para la vida deben protegerse para la salud, la nutrición y los medios de vida. Este estudio señala la contaminación por metales pesados ​​en los recursos hídricos naturales y los efectos tóxicos de esta contaminación en un organismo bioindicador de la cadena alimentaria. Para prevenir esta toxicidad, que puede llegar a animales y humanos a través de la cadena alimentaria, se debe dar importancia a los recursos hídricos y protegerlos mediante legislación. Además, se deben mantener en la agenda estrategias de solución que reduzcan la contaminación del agua y prevengan los efectos tóxicos.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Este estudio no ha sido apoyado financieramente por ninguna institución.

Departamento de Biología, Instituto de Ciencias, Universidad de Giresun, Giresun, Turquía

Mahmut Dogan

Departamento de Biología, Facultad de Ciencias y Arte, Universidad de Giresun, Giresun, Turquía

Kültıkin Çavuşoğlu y Emine Yalçin

Departamento de Técnicas y Servicios Médicos, Escuela Vocacional de Servicios de Salud, Universidad de Giresun, Giresun, Turquía

Ali Akar

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Correspondencia a Emine Yalçin.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Doğan, M., Çavuşoğlu, K., Yalçin, E. et al. Detección integral de la toxicidad del agua del arroyo Pazarsuyu que contiene metales pesados ​​y función protectora del licopeno. Informe científico 12, 16615 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-21081-y

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Recibido: 09 de agosto de 2022

Aceptado: 22 de septiembre de 2022

Publicado: 05 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-21081-y

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