El derivado amida del ácido anticopálico induce no

Dec 13, 2023

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13456 (2023) Citar este artículo

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Se evaluó la actividad citotóxica del cáncer del ácido anticopálico (ACP), un diterpenoide de tipo labdano obtenido de los rizomas de Kaempferia elegans, junto con 21 derivados semisintéticos. La mayoría de los derivados mostraron una mayor actividad citotóxica que el compuesto original ACP en un panel de nueve líneas celulares cancerosas. Entre los compuestos probados, la amida 4p mostró la mayor actividad citotóxica hacia las líneas celulares de leucemia, HL-60 y MOLT-3, con valores de CI50 de 6,81 ± 1,99 y 3,72 ± 0,26 µM, respectivamente. Más interesante aún, el derivado de amida 4l exhibió actividad citotóxica con una CI50 de 13,73 ± 0,04 µM contra la línea celular de cáncer de mama triple negativo MDA-MB-231, que es el tipo más agresivo de cáncer de mama. Los estudios mecanicistas revelaron que 4l inducía la muerte celular en células MDA-MB-231 mediante una muerte celular regulada no apoptótica. Además, el análisis de transferencia Western mostró que el compuesto 4l disminuyó la fosforilación de la proteína FAK de una manera dependiente de la concentración. Las simulaciones de acoplamiento molecular aclararon que el compuesto 4l podría potencialmente inhibir la activación de FAK uniéndose a una bolsa del dominio quinasa de FAK. Los datos sugirieron que el compuesto 4l podría ser un posible inhibidor de FAK para el tratamiento del cáncer de mama triple negativo y que merecería ser investigado más a fondo.

El cáncer es la enfermedad devastadora del mundo y el cáncer de mama es la segunda causa de muerte entre todos los tipos de cáncer1. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), alrededor de 7,8 millones de mujeres en todo el mundo fueron diagnosticadas con cáncer de mama en el año 20202. Aunque es poco común, el cáncer de mama también ocurre en hombres y personas transgénero3. El cáncer de mama es una enfermedad muy compleja clasificada en muchos subtipos, cada uno con sus propias características biológicas, perfiles de expresión genética y comportamientos clínicos4. Entre los subtipos de cáncer de mama, el cáncer de mama triple negativo (TNBC) es el más agresivo y tiene la tasa de recurrencia, diseminación metastásica y riesgos de mortalidad más altos5. TNBC se caracteriza por la falta de expresión del receptor de estrógeno (ER), del receptor de progesterona (PR) y del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2). Este subtipo representa aproximadamente el 15% de todos los cánceres de mama diagnosticados y el 25% de todas las muertes relacionadas con el cáncer de mama4. Debido a la falta de receptores específicos adecuados, los tratamientos comunes para el cáncer de mama, como la terapia hormonal y la terapia dirigida contra ER, PR y HER2, son ineficaces en pacientes con TNBC. Como resultado, el TNBC tiene opciones de tratamiento limitadas y se sabe que tiene un peor resultado clínico que otros subtipos de cáncer de mama. La quimioterapia sigue siendo un tratamiento estándar para el TNBC, pero con frecuencia se produce quimiorresistencia5. Estos problemas indican la importancia de encontrar nuevos medicamentos u opciones de tratamiento eficaces para el TNBC.

Los productos naturales han contribuido durante mucho tiempo al descubrimiento de fármacos, especialmente para el cáncer y las enfermedades infecciosas6,7. Sirven como buenas fuentes de nuevos medicamentos, ya que suelen ser materiales asequibles y tienen diversos soportes, farmacóforos y accesibilidad. Además, combinados con la síntesis química, los productos naturales se pueden utilizar como puntos de partida para acceder a diversas estructuras moleculares con bioactividad amplificada y biodisponibilidad deseada. Por estas razones, el concepto de aislar un producto natural para estudios de optimización de clientes potenciales o la generación de bibliotecas de detección se ha informado regularmente en la literatura8. Sin embargo, para que esta estrategia sea efectiva se requiere (1) acceso a suministros adecuados para el aislamiento a gran escala del producto natural deseado, (2) la gran abundancia del producto natural de interés de la fuente del producto natural, y (3) la Presencia de funcionalidades químicas en la estructura del producto natural que permite la generación de derivados simples y de alto rendimiento. Por lo tanto, los productos naturales que podrían cumplir con estos criterios se consideran buenas fuentes para un programa de descubrimiento de fármacos basado en productos naturales.

El ácido anticopálico (ACP), conocido como ácido (+)-copálico (Fig. 1), es un diterpenoide bicíclico de tipo labdano previamente aislado de varias plantas, incluidas Vitex hemsley9, Eperua purpurea10, Eperua leucantha11, Pinus monticola12,13, Pinus strobus13 y Oxystigma oxyphyllum14,15. En 2018, nuestro grupo aisló ACP en grandes cantidades (~ 23%) del extracto crudo de los rizomas de Kaempferia elegans16,17. Dado que Kaempferia elegans es una planta de la familia del jengibre, que se puede cultivar fácilmente, y se considera que la ACP tiene un soporte de producto natural particularmente atractivo debido a su bajo PM (304 Da), múltiples centros estereogénicos (n = 3, lo que confiere una Forma 3D), y que contiene un posible mango químico, como ácido carboxílico en la molécula. Por lo tanto, el ACP puede ser un buen candidato como punto de partida para la optimización de nuevos agentes bioactivos basados ​​en productos naturales. Cabe mencionar que el ácido anticopálico es uno de los raros productos naturales que presenta ambas formas enantioméricas que se encuentran en la naturaleza18. El ácido (-)-copálico (COPA) (Fig. 1), la forma enantiomérica opuesta del ACP, es el principal diterpenoide presente en la medicina popular, el aceite de copaiba19.

Ácido (-)-copálico (COPA) y ácido (+)-copálico (ácido anticopálico, ACP).

Basado en la aplicación integral del aceite de copaiba en la medicina popular y su reciente popularidad en las industrias cosmética y farmacéutica, COPA y sus derivados han sido sometidos a diversos estudios científicos con el objetivo de probar sus actividades biológicas. Estudios anteriores revelaron que COPA posee bioactividades interesantes, incluidas propiedades antibacterianas20,21, antifúngicas22, antiinflamatorias23,24, antituberculosas25 y citotóxicas para el cáncer26. También se han informado estudios de derivados de COPA que ofrecieron bioactividades superiores a las del COPA original. Por ejemplo, el derivado de COPA hidrogenado y los derivados de COPA con restos de epóxido, dicetona o carboxilato de sodio proporcionaron una actividad antituberculosa mucho mayor21,25. Algunos análogos de la amida COPA mejoraron su actividad en la regulación negativa de la expresión del receptor de andrógenos para el tratamiento del cáncer de próstata27.

A diferencia de COPA, se sabe poco sobre las bioactividades de ACP. Hasta la fecha sólo se han reportado actividad antimicrobiana de la ACP16,28 y actividad antialimentaria contra Spodoptera frugiperda de la ACP y derivados9. En vista de los limitados estudios existentes sobre las bioactividades del ACP y el uso potencial del ACP en el descubrimiento de fármacos basados ​​en productos naturales, nos embarcamos en la síntesis y evaluación citotóxica de los derivados del ACP. En este documento, se evaluó la actividad citotóxica de los derivados de ACP, principalmente los análogos de amida, contra nueve líneas celulares cancerosas y la línea celular normal MRC-5. Además, se dilucidaron los mecanismos moleculares y los objetivos biológicos del derivado 4l de ACP en células de cáncer de mama triple negativo MDA-MB-231.

La formación de los derivados de ACP 1–3 y 4a–4s se realizó como se ilustra en la Fig. 2. Estos incluyeron la reducción al alcohol 2, el aldehído 3, la amidación a los análogos de amida 4a–4r y la hidrólisis adicional del éster metílico de amida 5q al ácido 4s. Es de destacar que la mayoría de los derivados son análogos de amida debido a su idoneidad para realizar rápidamente estudios sobre la relación estructura-actividad (SAR). De hecho, la formación de amida tiende a ser la más utilizada por los químicos medicinales, y los enlaces amida están ampliamente presentes en las sustancias farmacéuticamente activas, y se estima que se encuentran en el 25% de los medicamentos comercializados29.

Síntesis de derivados de ACP.

El rendimiento de los derivados sintetizados fue de moderado a excelente (20-100%). De estos derivados, se informaron por primera vez diecinueve compuestos de derivados de amida. Las estructuras de los compuestos sintetizados se confirmaron mediante análisis de datos espectroscópicos de RMN y EM. Las características físicas y los datos espectroscópicos de los compuestos sintetizados se informan en la Información complementaria.

Los compuestos sintéticos se analizaron para determinar su actividad citotóxica utilizando métodos estándar MTT o XTT30 frente a un panel de nueve líneas celulares de cáncer humano y una línea celular normal, incluida MDA-MB-231 (cáncer de mama triple negativo), T-47D (cáncer de mama triple negativo), cáncer de mama dependiente), HepG2 (carcinoma hepatocelular), A549 (adenocarcinoma de pulmón), H69AR (carcinoma de pulmón de células pequeñas multirresistente), HuCCA-1 (colangiocarcinoma derivado de un paciente tailandés), HeLa (carcinoma cervical) y dos células de leucemia líneas, HL-60 (leucemia promielocítica aguda) y MOLT-3 (leucemia linfoblástica aguda de células T). Se utilizó la línea celular de fibroblastos de pulmón embrionario normal MRC-5 para representar células normales. Como controles positivos se utilizaron fármacos quimioterapéuticos, doxorrubicina y etopósido. Los valores de CI50 de los compuestos probados se dan en la Tabla 1.

Los resultados mostraron que la actividad citotóxica de casi todos los compuestos de esta serie era mayor que la del compuesto original ACP. Varios derivados demostraron una actividad citotóxica selectiva hacia las líneas celulares de leucemia, HL-60 y MOLT-3, por lo que el compuesto 4p exhibió la actividad más potente con IC50 de 6,81 ± 1,99 µM para HL-60 y 3,72 ± 0,26 µM para MOLT-3. Además, un compuesto derivado 4l exhibió una notable actividad citotóxica contra la línea celular TNBC MDA-MB-231, con una IC50 de 13,73 ± 0,04 µM.

El TNBC es el tipo más agresivo de cáncer de mama humano y actualmente no existen tratamientos eficaces5. Según la selección, entre los compuestos probados, el compuesto 4l ha demostrado la citotoxicidad más prometedora y el índice de selectividad más alto hacia las células MDA-MB-231 (Tabla 1, Tabla complementaria S1). Además, este compuesto mostró un índice de selectividad superior (SI = 2,9) en comparación con el fármaco positivo doxorrubicina (SI = 0,3) (consulte la Tabla complementaria S1). Dado este potencial, se eligió el compuesto 4l para investigar más a fondo su mecanismo citotóxico en células MDA-MB-231 con el fin de desarrollar nuevos fármacos para el tratamiento del TNBC.

Nuestro cribado citotóxico incluye múltiples líneas celulares cancerosas derivadas de diferentes orígenes de órganos (mama, hígado, conducto biliar, pulmón, cuello uterino y linfocitos), mientras que solo se utilizó una línea celular normal (fibroblasto pulmonar MRC-5) como representante de las células normales. . La línea celular MRC-5 es una línea celular normal bien conocida que se ha utilizado ampliamente en el cribado citotóxico31,32. Esta línea celular se puede cultivar fácilmente en medio estándar sin el uso de suplementos especiales. Los fibroblastos son un tipo de célula común presente en el tejido conectivo de muchos órganos. La evaluación del índice de selectividad (SI) basada en la citotoxicidad contra la línea celular MRC-5 refleja el grado de efecto secundario de los compuestos probados contra un tipo de célula ampliamente distribuido en el cuerpo, pero no implica el efecto secundario en órganos específicos. lo cual es una limitación de nuestro estudio.

La modalidad de muerte celular ha sido categorizada en muerte celular accidental no regulada (necrosis) y 12 tipos de muerte celular regulada por el Comité de Nomenclatura sobre Muerte Celular, según las características morfológicas, los eventos bioquímicos durante el inicio de la muerte celular y las vías de señalización involucradas33. La muerte celular regulada se puede clasificar en modos de muerte celular apoptótica (apoptosis y anoikis) y modos de muerte celular no apoptótica, que se dividen en 2 grupos según la presencia de acumulación de vacuolas, como la autofagia, o la ausencia de vacuolas, como la necroptosis34. . La mayoría de los productos naturales citotóxicos reportados inducen la muerte de las células cancerosas mediante apoptosis. Aún así, hallazgos recientes demostraron que varios productos naturales ejercieron su actividad citotóxica mediante la inducción de modos de muerte celular no apoptóticos, como la autofagia inducida por resveratrol y la necroptosis inducida por shikonina35,36.

Se exploró el modo de muerte celular inducida por el compuesto 4l utilizando células MDA-MB-231 observando el cambio en la morfología celular y el análisis de citometría de flujo de células teñidas doblemente con anexina V/7-AAD. Las células se trataron con 4 litros durante 24 a 48 h, a concentraciones de 25 a 50 µM, que son superiores al valor de CI50 en esta línea celular. Microscópicamente, el tratamiento con 4 litros no produjo la formación inmediata de burbujas en la superficie celular (Fig. 3a). La necrosis por muerte celular accidental suele estar indicada por la producción inmediata de burbujas en la superficie celular después del tratamiento37. Sin embargo, este cambio morfológico no se observó en las células tratadas con 4l, lo que indica que el tratamiento con 4l no indujo necrosis. Además, no se observó acumulación de vacuolas en las células tratadas hasta 48 h después del tratamiento (Fig. 3a). En conjunto, planteamos la hipótesis de que la muerte celular inducida por 4l en células MDA-MB-231 no se procesó mediante necrosis o muerte celular regulada por presentación de vacuolas, como la autofagia.

Modo de muerte celular en células de cáncer de mama MDA-MB-231 tratadas con el compuesto 4l. Las células se trataron con 4 l, doxorrubicina (DOX), shikonina (SKN) en las concentraciones indicadas durante 24 a 48 h. Luego se tomaron fotografías y las células se sometieron a doble tinción con anexina V/7-AAD y se analizaron mediante la técnica de citometría de flujo. ( a ) Morfología de las células tratadas con 4l, aumento original de × 400. ( b, d ) Gráficos de puntos representativos del análisis de citometría de flujo de las células tratadas que muestran los porcentajes de células vivas (abajo a la izquierda), células apoptóticas tempranas (abajo a la derecha) , células apoptóticas tardías (arriba a la derecha) y células muertas (arriba a la izquierda). (c,e) Gráficos de barras que muestran porcentajes de células apoptóticas tempranas, células apoptóticas tardías y células muertas en una población celular total. Los datos se expresan como media ± DE de tres experimentos independientes. Las diferencias significativas entre el tratamiento y el control en los puntos temporales correspondientes se muestran con *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001, y las diferencias significativas entre 24 h y 48 h se indican con &p < 0,05, &&p < 0,01 y &&&p < 0,001.

Curiosamente, el análisis de citometría de flujo con doble tinción con anexina V/7-AAD mostró que el tratamiento con 4 l aumentó notablemente la población de células apoptóticas tardías en células MDA-MB-231, de una manera dependiente de la dosis y el tiempo. En comparación, el porcentaje de población de células apoptóticas tempranas no cambió significativamente con el tiempo (Fig. 3b, c). A las 48 h, la población de células apoptóticas tardías aumentó significativamente del 5,8% para el grupo de control al 19,0–26,3% para 4 litros a 25–50 µM (Fig. 3c). Por el contrario, las poblaciones de células apoptóticas tempranas de los tratamientos con 4l oscilaron entre 5,3 y 5,9%, lo que no fue estadísticamente diferente del 4,2% encontrado en el grupo de control (Fig. 3c), lo que indica que el proceso de muerte celular inducida por 4l no progresar a través de la apoptosis en etapa temprana.

Para comparar los perfiles de tinción doble de anexina V / 7-AAD de los modos de muerte celular apoptótica y no apoptótica, se emplearon doxorrubicina (DOX) y shikonina (SKN) como inductores de apoptosis y necroptosis, respectivamente. Como se muestra en la Fig. 3d, e, en la muerte celular inducida por DOX, la población de células apoptóticas tempranas fue mayor que la población de células apoptóticas tardías a las 24 h. Luego disminuyó a las 48 h, concomitantemente con un aumento dependiente del tiempo en la población de células apoptóticas tardías (Fig. 3e). SKN, por otro lado, mostró un aumento dependiente del tiempo en la población de células apoptóticas tardías durante el tratamiento de 24 a 48 h, mientras que la población de células apoptóticas tempranas no se elevó a lo largo del tiempo (Fig. 3e). El perfil de tinción doble con anexina V/7-AAD de las células tratadas con 4l difiere del del inductor de apoptosis y se parece al del inductor de necroptosis.

En conjunto, los resultados sugirieron que la muerte celular inducida por 4l en células MDA-MB-231 estaba mediada por una muerte celular regulada no apoptótica, como lo indica un aumento dependiente del tiempo en la población apoptótica tardía sin un aumento en la población apoptótica temprana. Además, la morfología de las células tratadas con 4l no mostró una acumulación de vacuolas autofágicas, excluyendo la posibilidad de muerte celular autofágica. La necroptosis, ferroptosis, mitoptosis, parthanatos, NETosis y piroptosis son modos de muerte celular no apoptóticos que no resultan en acumulación de vacuolas32. Sin embargo, el modo preciso de muerte celular inducida por el compuesto 4l se investigará más a fondo mediante múltiples análisis bioquímicos.

La mayoría de los fármacos quimioterapéuticos que se utilizan actualmente eliminan los tumores induciendo la apoptosis en las células cancerosas. Sin embargo, la tolerancia a la apoptosis causada por la desregulación de la maquinaria apoptótica es un mecanismo que contribuye al desarrollo de resistencia a múltiples fármacos del cáncer, que es una de las principales causas de fracaso del tratamiento quimioterapéutico38. La inducción del modo de muerte celular no apoptótica mediante moléculas pequeñas es una estrategia atractiva para superar el problema de la evasión de la apoptosis39. Por lo tanto, la capacidad del compuesto 4l para inducir la muerte celular no apoptótica es de interés, lo que sugiere que el compuesto es prometedor para el futuro desarrollo de fármacos contra el cáncer.

Investigamos más a fondo los objetivos del compuesto 4l en las vías de señalización de supervivencia celular, incluidos EGFR, FAK, Akt y ERK en células MDA-MB-231. Después del tratamiento con 4 l en concentraciones de 25 a 50 µM durante 24 h, se determinó la activación (fosforilación) de las vías de señalización mediante análisis de transferencia Western. Como se muestra en la Fig. 4, la fosforilación de la proteína FAK se redujo selectivamente en 4 litros de manera dependiente de la dosis, mientras que la fosforilación de EGFR, Akt y ERK no se vio afectada por el tratamiento, lo que sugiere que la inhibición de FAK podría ser el mecanismo citotóxico del compuesto. 4l.

Efecto inhibidor del compuesto 4l sobre las vías de señalización de supervivencia celular en células MDA-MB-231. Después de 24 h de tratamiento con el compuesto 4l, se detectaron niveles de fosforilación de proteínas de señalización seleccionadas en las células tratadas mediante análisis de transferencia Western. Los resultados son transferencias representativas de tres experimentos independientes.

Para determinar si la inhibición de FAK es un mecanismo implicado en la inducción de muerte celular no apoptótica por el compuesto 4l en células MDA-MB-231, las células se trataron con un inhibidor específico de FAK (1,2,4,5-bencenotetraamina o FAKi). a una concentración citotóxica (16 μM), seguido de un análisis del modo de muerte celular. Como se muestra en la Fig. 5a, después de 24 h de tratamiento, la fosforilación de FAK se inhibió claramente en las células tratadas con FAKi. A lo largo del período de tratamiento de 48 h, se observó un aumento dependiente del tiempo en la población de células apoptóticas tardías en las células tratadas con FAKi, que siempre fue mayor que la población de células apoptóticas tempranas (Fig. 5b, c). Los resultados indicaron que la inhibición de FAK en células MDA-MB-231 provocó una muerte celular no apoptótica, similar a la observada en las células tratadas con 4l.

Modo de muerte celular en células MDA-MB-231 expuestas al inhibidor específico de FAK (FAKi). Las células se trataron con FAKi (16 μM) durante 24 a 48 h. ( a ) Análisis de transferencia Western de la fosforilación de FAK a las 24 h después del tratamiento. ( b ) Gráficos de puntos representativos del análisis de citometría de flujo de las células tratadas. (c) Gráficos de barras que muestran porcentajes de células apoptóticas tempranas, células apoptóticas tardías y células muertas en la población celular total. Los datos se expresan como media ± DE de tres experimentos independientes. Las diferencias significativas entre el tratamiento y el control en el momento correspondiente se muestran con *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001, y las diferencias significativas entre 24 y 48 h se indican con &&p < 0,01.

Varias líneas de evidencia indican que FAK regula la supervivencia celular, así como varias características malignas de las células cancerosas y con frecuencia se sobreexpresa en una amplia gama de tumores40. Se ha informado que la señalización FAK está involucrada en la resistencia a la radio y la quimioterapia de los cánceres. La regulación negativa de FAK aumenta el efecto citotóxico de la radiación en las células de cáncer de colon41 y también mejora la sensibilidad al cisplatino en las células TNBC42. La evaluación in vivo de una molécula pequeña inhibidora de FAK BI 856520 en modelos murinos de cáncer de mama arroja resultados prometedores sobre la supresión del crecimiento del tumor primario y el crecimiento de tumores metastásicos, al alterar la proliferación celular tanto in vitro como in vivo43. Actualmente se están probando varios inhibidores de FAK en ensayos clínicos en varios tipos de cáncer, ya sea como terapia única o en combinación con otros fármacos anticancerígenos44. Por lo tanto, el compuesto 4l podría ser un compuesto potencial para desarrollarse como agente quimioterapéutico para tratar el TNBC.

Para explorar la unión entre FAK y el compuesto 4l, el acoplamiento molecular se realizó utilizando el software iGEMDOCK v2.1. Se utilizaron como receptor dos posibles sitios de unión para el inhibidor de molécula pequeña en la proteína FAK, el dominio FERM y el dominio quinasa. A diferencia de FAKi, que se ha demostrado que se une al dominio FERM en un bolsillo cerrado a Tyr39745, el sitio de unión de 4l en el dominio FERM parece estar lejos del bolsillo Tyr397 (Fig. 6a). Por otro lado, el sitio de unión de 4l en el dominio quinasa estaba ubicado en un bolsillo de unión de ATP (Fig. 6b), que era idéntico al sitio de unión de otro inhibidor específico de FAK, TAE22646, lo que indica que se inhibiría la actividad catalítica de FAK. tras encuadernación de 4l. Estos resultados sugirieron que el compuesto 4l redujo la autofosforilación de FAK en Tyr397 al interferir con la actividad de la quinasa FAK mediante la unión al dominio quinasa en lugar del dominio FERM.

Las posiciones de unión de 4l en la proteína FAK. (a) Se indica el dominio FAK FERM (PDB:2AL6), el sitio de fosforilación Tyr397, tres subdominios están etiquetados con colores violeta (F1), verde (F2) y rojo (F3), y el compuesto 4l se muestra en una barra rosa. (b) Dominio quinasa FAK (PDB ID: 2JKK) con el compuesto 4l (barra rosa) y TAE226 (barra amarilla) en el bolsillo de unión de ATP (gris).

Como se ilustra en la Fig. 7a, el TAE226 reacoplado se ubicó en la misma posición que el TAE226 cocristalizado, lo que indica que nuestro método de acoplamiento era aceptable. La energía de enlace de TAE226 fue de -134,05 kcal/mol, y TAE226 formó dos enlaces de hidrógeno con Asp564 y Cys502 (Fig. 7b). Además, como se muestra en la Tabla 2, 4l tenía una energía de enlace de −80,44 kcal/mol. La Figura 7c demuestra que 4l formó un enlace de hidrógeno con Cys502 del dominio quinasa FAK. Los anillos de ciclohexano fusionados, el carbono metílico y el carbono metileno de 4l también hicieron contactos hidrofóbicos con Ile428 y Leu501 (Fig. 7d). También se puede observar que hubo interacciones hidrofóbicas entre el anillo de tetrahidropirano de 4l y cuatro cadenas laterales de aminoácidos, incluidas Ala452, Val484, Met499 y Leu553 (Fig. 7d). Esto indica que los anillos de ciclohexano fusionados y el anillo de tetrahidropirano de 4l pueden actuar como restos clave en la unión al sitio catalítico de FAK, lo que convierte a 4l en un posible inhibidor de FAK.

Superposición de TAE226 reacoplado (rojo) y TAE226 cocristalizado (amarillo) (a), interacción por enlace de hidrógeno de TAE226 (b), interacción por enlace de hidrógeno de 4l (rosa) (c) y diagrama 2D que representa las interacciones de 4l (d) en el bolsillo de unión de ATP del dominio quinasa FAK (PDB ID: 2JKK).

Para evaluar la farmacobilidad47,48 del compuesto 4l se utilizó el servicio del sitio web SwissADME para estudiar las propiedades fisicoquímicas y el análisis mediante las reglas de Lipinski y Veber. También se realizó el cálculo del compuesto original ACP para compararlo con 4l. Los parámetros calculados se presentan en la Tabla 3. Considerando la regla de cinco de Lipinski, los parámetros de estos dos compuestos, incluido el peso molecular, el número de aceptores de enlaces de hidrógeno y el número de donantes de enlaces de hidrógeno, cumplieron la regla. Sin embargo, los valores de MLogP, que representan la lipofilicidad del compuesto, son ligeramente mayores que el requisito informado (4.15)49. Estos valores MLogP son consistentes con los valores LogS, que indicaron la menor solubilidad en agua de estos compuestos. Sin embargo, el compuesto 4l y el ACP tienen un alto grado de fracción sp3 (Fsp3), lo que indica un alto grado de saturación y contenido de quiralidad, lo que podría promover una preferencia significativa por la unión y la selectividad a las proteínas. Por último, el compuesto 4l y el ACP tienen valores de TPSA mucho menores que 140 Å2, lo que indica una buena permeabilidad de la membrana celular, ya que las moléculas con un valor de TPSA superior a 140 (Å2) tienden a ser deficientes para permear las membranas celulares50. Además, la introducción de sustituyentes amida conduce a un aumento en el TPSA de 4 l, lo que hace que el valor de TSPA de 4 l se acerque al rango atribuido al fármaco más exitoso (≤ 60–70 Å2). Según los parámetros fisicoquímicos, tanto el 4l como el ACP exhibieron parámetros adecuados para la capacidad farmacológica adecuada, excepto la solubilidad de los compuestos. La modificación química de los compuestos originales en el descubrimiento de fármacos generalmente tiene como objetivo mejorar las propiedades fisicoquímicas o la potencia de los fármacos, o ambas. En este estudio, aunque el compuesto 4l no mostró una mejora en términos de parámetros fisicoquímicos en comparación con el compuesto original ACP, el compuesto 4l mostró una potencia mucho mayor que el ACP, lo que indica una mejora en la potencia de los fármacos a partir de la modificación. Una mayor derivatización de los compuestos podría permitir mejores valores fisicoquímicos que se ajusten a las directrices de similitud de fármacos.

Los espectros de RMN 1H y 13C se registraron en CDCl3 o DMSO-d6 usando un espectrómetro Bruker AVANCE 300 NMR o Bruker AVANCE 400 NMR. Desplazamientos químicos (δ) de 1H-NMR y 13C-NMR. Los desplazamientos químicos se expresaron en ppm y se hicieron referencia a las señales del disolvente residual. Las constantes de acoplamiento (J) se informaron en Hertz (Hz). Los espectros IR se registraron en un espectrómetro PerkinElmer Spectrum One utilizando una técnica de reflectancia atenuada universal (ATR) y se expresan en cm-1. El análisis HRESIMS se determinó utilizando un espectrómetro microTOF de Bruker Daltonics. Las rotaciones ópticas se midieron en un polarímetro JASCO P-1020. Todo el material de vidrio se secó con calor antes de su uso. Las TLC se visualizaron usando luz UV (254 y 366 nm) y reactivo de Godin.

Los rizomas de K. elegans de tipo salvaje utilizados en este estudio procedían de la zona rural del distrito de Sai Yok, provincia de Kanchanaburi, Tailandia, y fueron recolectados por la población local que vive en la zona con su permiso. La planta fue autenticada por un taxónomo, el Profesor Dr. Wongsatit Chuakul de la Facultad de Farmacia de la Universidad Mahidol, Tailandia. El comprobante de muestra número BKF 192.348 (Thongnest No. 2) fue depositado en el Departamento de Parques Nacionales, Conservación de Plantas y Vida Silvestre, Ministerio de Recursos Naturales y Medio Ambiente, Bangkok, Tailandia. Todos los procedimientos para la recolección de plantas se realizaron de acuerdo con las directrices y legislación institucionales, nacionales e internacionales pertinentes.

Todos los disolventes se destilaron a partir de disolventes de calidad comercial salvo que se indique lo contrario. Se purificó adicionalmente diclorometano (CH2Cl2) mediante filtración a presión a través de alúmina activada para preparar la reacción. Se utilizaron disolventes de grado espectral para las mediciones espectroscópicas. La cromatografía en capa fina se realizó en placas Merck prerrecubiertas con gel de sílice 60 F254. Se usó gel de sílice 60 (Silicycle, malla 230–400) para la cromatografía en columna ultrarrápida y gel de sílice 60 PF254 (Merck) para la cromatografía en capa fina preparativa. Para la detección por TLC se utilizaron placas de aluminio recubiertas previamente con gel de sílice (F254, 0,25 mm). El kit Muse® Anexo V y células muertas se adquirió de Luminex (Austin, TX, EE. UU.). La doxorrubicina, el etopósido y la shikonina se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El inhibidor específico de FAK (tetrahidrocloruro de 1,2,4,5-bencenotetraamina o inhibidor de FAK 14) se adquirió de Tocris Bioscience (Bristol, Reino Unido). El cóctel inhibidor de proteasa/fosfatasa y todos los anticuerpos se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EE. UU.). Los sustratos SuperSignal ™ ECL se adquirieron de Thermo Scientific (Rockford, IL, EE. UU.).

MDA-MB-231 (cáncer de mama triple negativo), T-47D (cáncer de mama dependiente de hormonas), HepG2 (carcinoma hepatocelular), HL-60 (leucemia promielocítica aguda), MOLT-3 (leucemia linfoblástica aguda de células T) , A549 (adenocarcinoma de pulmón), H69AR (carcinoma de pulmón de células pequeñas resistente a múltiples fármacos), HeLa (carcinoma cervical) y MRC-5 (fibroblasto de pulmón embrionario normal) se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA, EE. UU. ). HuCCA-1 (colangiocarcinoma derivado de un paciente tailandés) se obtuvo del Laboratorio de Inmunología del Instituto de Investigación Chulabhorn, Tailandia.

Los rizomas de K. elegans (25 kg) se extrajeron con diclorometano (2 x 70 l) a temperatura ambiente. Después de evaporar el disolvente, se obtuvo un extracto bruto (420,6 g). El extracto crudo de diclorometano (420,6 g) se cromatografió sobre una columna de gel de sílice, usando un sistema de gradiente por etapas con hexano-CH2Cl2 (100:0 a 0:100) y CH2Cl2-MeOH (100:0 a 0:100) para producir dieciocho fracciones. (F1-F18) después de la detección de TLC. Una de las fracciones ricas en ACP (Fracción F7, 38,5 g) se purificó mediante cromatografía en columna de sílice eluida con n-hexano-CH2Cl2 (95:5 a 0:100) y CH2Cl2-MeOH (100:0 a 90:10) para dar ACP puro como amorfo blanco (34,5 g). La estructura del ACP obtenido del extracto de la planta se identificó basándose en datos espectrales de RMN de 1H y 13C en comparación con los datos anteriores16. A su debido tiempo se utilizarán otras fracciones ricas en ACP para el aislamiento futuro.

A una solución de ACP (25 mg, 0,08 mmol, 1,0 equiv.) en CH2Cl2 (0,8 ml, 0,1 M) se le añadió HOBt (16,5 mg, 0,12 mmol, 1,5 equiv.) y EDCl (23,4 mg, 0,12 mmol, 1,5 equiv. ). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 min y luego se concentró al vacío. El residuo se disolvió en THF (0,8 ml, 0,1 M) y se enfrió a 0 °C, y se añadió NaBH4 (9,2 mg, 0,24 mmol, 3,0 equiv.) a la mezcla. Luego, se añadió H2O (2 µl, 0,12 mmol, 1,5 equiv.) a una solución. La mezcla resultante se agitó a 0 °C durante 30 min y luego se inactivó con MeOH (1 ml). La mezcla se secó al vacío y se redisolvió en EtOAc. La capa orgánica se lavó con ácido cítrico al 10% y salmuera, se secó sobre Na2SO4 y se concentró al vacío. El producto se purificó mediante cromatografía en columna eluyendo con EtOAc:hexano (10:90) para proporcionar 6 mg (25%) de anticopalol (2)16 como un aceite incoloro. \({[\mathrm{\alpha }]}_{\mathrm{D}}^{27}\) = + 30,3 (c 0,95, CHCl3); FTIR (puro) Ѵmáx: 3356, 2923, 2847, 1662, 1642, 1457, 1442, 1387, 996, 887 cm‒1; RMN 1H (600 MHz, CDCl3) δH 4,83 (1H, d, J = 1,3 Hz, H-17), 4,51 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-17), 4,18 (1H, dd, J = 6,9 , 1,2 Hz, H-14), 4,18 (1H, d, J = 6,9 Hz, H-15), 2,40 (1H, ddd, J = 12,8, 4,2, 2,5 Hz, H-7), 2,16 (2H, ddd , J = 14,0, 9,8, 4,0 Hz, H2-12), 1,98 (1H, td, J = 12,9, 5,0 Hz, H-7), 1,76 (1H, m, H-1), 1,71 (1H, m, H-6), 1,67 (3H, s, H3-16), 1,61 (1H, m, H-11), 1,57 (1H, m, H-9), 1,56 (1H, m, H-2), 1,49 (1H, m, H-2), 1,43 (1H, m, H-11), 1,39 (1H, m, H-3), 1,32 (1H, tdd, J = 12,9, 12,9, 4,3 Hz, H-6 ), 1,18 (1H, td, J = 12,8, 4,9 Hz, H-3), 1,10 (1H, dd, J = 12,5, 2,7 Hz, H-5), 0,90 (3H, s, H3-19), 0,80 (3H, s, H3-18), 0,67 (3H, s, H3-20); RMN 13C (150 MHz, CDCl3) δ 148,6 (C-8, s), 140,6 (C-13, s), 123,1 (C-14, d), 106,2 (C-17, t), 59,4 (C-15 , t), 56,4 (C-9, d), 55,6 (C-5, d), 42,2 (C-3, t), 39,7 (C-10, s), 39,1 (C-1, t), 38,5 (C-12, t), 38,4 (C-7, t), 33,7 (C-19, q), 33,6 (C-4, s), 24,5 (C-6, t), 21,9 (C-11, t), 21,7 (C-19, q), 19,4 (C-2, t), 19,3 (C-16, q), 14,5 (C-20, q); EM ESI-TOF: calculado para C20H34NaO, m/z 313,2502 [M + Na]+ encontrado 340,2502.

Se disolvió anticopalol (2) (5,5 mg, 0,018 mmol, 1,0 equiv.) en CH2Cl2 (0,18 ml, 0,1 M). Luego, se añadió lentamente a la mezcla periodinano de Dess-Martin (9,6 mg, 0,022 mmol, 1,2 equiv.). La solución se mantuvo en agitación a temperatura ambiente durante 3 h. La reacción se procesó con NH4Cl (ac.). La mezcla se extrajo con EtOAc y salmuera y se secó sobre Na2SO4. El extracto bruto se concentró al vacío y se purificó mediante cromatografía en columna eluyendo con EtOAc:hexano (20:80) para dar 6,6 mg (100%) del aldehído 3 como un aceite amarillo. \({[\mathrm{\alpha }]}_{\mathrm{D}}^{27}\) = + 10,5 3 (c 0,48, CHCl3); FTIR (puro) Ѵmáx: 2925, 2865, 1694, 1642, 1459, 1441, 1387, 1260, 1094, 1018, 887, 802 cm‒1; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δH 9,99 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-15), 5,87 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-14), 4,84 (1H, brs, H-17 ), 4,46 (1H, brs, H-17), 2,39 (1H, m, H-7), 2,32 (1H, m, H-12), 2,15 (3H, s, H3-16), 2,04 (1H, m, H-12), 1,94 (1H, m, H-7), 1,74 (1H, m, H-11), 1,74 (1H, m, H-6), 1,65 (1H, m, H-1) , 1,62 (1H, m, H-9), 1,50 (1H, m, H-11), 1,45 (2H, m, H2-2), 1,33 (1H, m, H-3), 1,25 (1H, m , H-6), 1,16 (1H, m, H-3), 1,10 (1H, m, H-5), 0,85 (3H, s, H3-19), 0,78 (3H, s, H3-18), 0,68 (3H, s, H3-20)); RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δC 191,3 (C-15, d), 164,9 (C-13, s), 148,1 (C-8, s), 127,1 (C-14, d), 106,3 (C-17 , t), 56,1 (C-9, d), 55,5 (C-5, d), 42,0 (C-3, t), 39,7 (C-12, t), 39,5 (C-10, s), 39,0 (C-1, t), 38,2 (C-7, t), 33,5 (C-4, s), 33,5 (C-19, q), 24,4 (C-6, t), 21,7 (C-18, q), 21,2 (C-11, t), 19,3 (C-2, t), 17,6 (C-16, q), 14,4 (C-20, q); ESI MS: calculado para C20H32NaO, m/z 311,2345 [M + Na]+ encontrado 311,2352.

Una mezcla de ACP (25 mg, 1,0 equiv.), hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) (1,5 equiv.), clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N′-etilcarbodiimida (EDCI) (1,5 equiv.), derivado de amina (1,5 equiv.) en CH2Cl2 (0,1 M) se agitó a 0 °C durante 5 min y luego se añadió lentamente a la mezcla N,N-diisopropiletilamina (DIPEA) (3 equiv.). La mezcla de reacción se agitó a 0 °C durante 15 min más y se agitó adicionalmente a temperatura ambiente durante 24 h. Luego, la reacción se detuvo con una solución acuosa de ácido clorhídrico 1 N y se extrajo con EtOAc (x 3). Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con salmuera y se secaron con MgSO4(s) para obtener una fracción cruda, que se purificó adicionalmente mediante cromatografía ultrarrápida en columna de gel de sílice, eluida con EtOAc:hexano o CH2Cl2:hexano para proporcionar los derivados de amida de ACP 4a–4r.

El residuo bruto se preabsorbió en gel de sílice y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna de gel de sílice usando una mezcla de CH2Cl2:MeOH (99:1) como eluyente para proporcionar 4a (17,2 mg, 67%) en forma de un aceite amarillo. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{25}\) +44,0 (c 1,69 CHCl3); FTIR (puro) Ѵmax: 3298, 3078, 2927, 2866, 2843, 1660, 1630, 1548, 1458, 1442, 1410, 1387, 1365, 1262, 1181, 886, 863, 737, 673 cm -1; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δH 5,49 (1H, s, H-14), 4,81 (1H, s, H2-17), 4,47 (1H, s, H2-17), 2,81 (3H, d , J = 5,0 Hz, H3-1ʹ), 2,36 (1H, ddd, J = 13,0, 4,0, 2,0 Hz, H2-7), 2,21 (1H, ddd, J = 14,0, 9,0, 4,0 Hz, H2-12) , 2,12 (3H, d, J = 2,0 Hz, H3-16), 1,96 (1H, m, H2-7), 1,87 (1H, m, H-12), 1,73 (1H, m, H2-1), 1,73 (1H, m, H2-6), 1,65 (1H, m, H2-11), 1,60 (1H, m, H2-2), 1,57 (1H, m, H-9), 1,53 (1H, m, H2-2), 1,47 (1H, m, H2-11), 1,43 (1H, m, H2-3), 1,30 (1H, dd, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-6), 1,17 (1H, td , J = 13,0, 4,0 Hz, H2-3), 1,05 (1H, dd, J = 13,0, 3,0 Hz, H-5), 0,96 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-1), 0,85 (3H, s, H3-18), 0,78 (3H, s, H3-19), 0,66 (3H, s, H3-20); RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δC 168,0 (C-15, s), 154,8 (C-13, s), 148,5 (C-8, s), 117,6 (C-14, d), 106,3 (C-17 , t), 56,1 (C-9, d), 55,5 (C-5, d), 42,1 (C-3, t), 39,7 (C-10, s), 39,5 (C-12, t), 39,0 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,6 (C-18, q), 33,6 (C-4, s), 26,0 (C-1ʹ, q), 24,4 (C-6, t), 21,7 (C-19, q), 21,5 (C-11, t), 19,4 (C-2, t), 18,2 (C-16, q), 14,5 (C-20, q); EM ESI-TOF: calculado para C21H35NNaO, m/z 340,2610 [M + Na]+ encontrado 340,2610.

El residuo bruto se preabsorbió en gel de sílice y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna de gel de sílice usando una mezcla de EtOAc:hexano (5:95) como eluyente para proporcionar 4b (21,4 mg, 78%) como un aceite amarillo. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{25}\) +38,3 (c 1,98, CHCl3); FTIR (puro) Ѵmax: 3293, 3078, 2926, 2866, 2844, 1660, 1630, 1536, 1459, 1442, 1388, 1365, 1256, 1178, 988, 915, 887 cm‒1. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 5,86 (1H, m, H-2ʹ), 5,53 (1H, dd, J = 2,4, 1,2 Hz, H-14), 5,20 (1H, m, H2-3ʹ), 5,13 (1H, m, H2-3ʹ), 4,83 (1H, d, J = 1,6 Hz, H2-17), 4,49 (1H, d, J = 1,2 Hz, H2-17), 3,92 (2H, tt, J = 6,0, 1,6 Hz., H2-1ʹ), 2,3389 (1H, ddd, J = 13,0, 4,4, 2,4 Hz, H2-7), 2,24 (1H, ddd, J = 12,0, 10,0, 4,4 Hz, H2-12) , 2,16 (3H, d, J = 1,2 Hz, H3-16), 1,97 (1H, m, H2-7), 1,91 (1H, m, H2-12), 1,75 (1H, m, H2-1), 1,72 (1H, m, H2-6), 1,67 (1H, m, H2-11), 1,58 (1H, m, H2-2), 1,55 (1H, m, H-9), 1,50 (1H, m, H2-2), 1,46 (1H, m, H2-11), 1,39 (1H, m, H2-3), 1,32 (1H, dd, J = 13,0, 4,4 Hz, H2-6), 1,17 (1H, td , J = 13,4, 4,2 Hz, H2-3), 1,08 (1H, dd, J = 12,0, 2,7 Hz, H-5), 1,01 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-1), 0,87 (3H, s, H3-18), 0,80 (3H, s, H3-19), 0,68 (3H, s, H3-20). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ 166,9 (C-15, s), 155,6 (C-13, s), 148,5 (C-8, s) 134,6 (C-2ʹ, d), 117,5 (C-14, d), 116,3 (C-3ʹ, t), 106,3 (C-17, t), 56,1 (C-9, d), 55,5 (C-5, d), 42,1 (C-1ʹ, t), 41,6 ( C-3, t), 39,7 (C-12, t), 39,6 (C-10, s), 39,0 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,6 (C-4, s ), 33,6 (C-18, q), 24,5 (C-6, t), 21,7 (C-19, q), 21,5 (C-11, t), 19,4 (C-2, t), 18,4 (C -16, q), 14,5 (C-20, q)); EM ESI-TOF: calculado para C23H37NNaO, m/z 366,2767 [M + Na]+, encontrado 366,2766.

El residuo bruto se preabsorbió en gel de sílice y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna de gel de sílice usando una mezcla de EtOAc:hexano (5:95) como eluyente para proporcionar 4c (21,1 mg, rendimiento cuantitativo) como un aceite amarillo. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{25}\) +32,9 (c 1,69, CHCl3); FTIR (puro) Ѵmáx: 3309, 2927, 2847, 1662, 1637, 1527, 1459, 1442, 1387, 1366, 1253, 1176, 1115, 886 cm‒1. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 5,59 (1H, br s, NH), 5,51 (1H, br d, J = 0,8 Hz, H-14), 4,83 (1H, d, J = 1,6 Hz, H2-17 ), 4,48 (1H, d, J = 1,2 Hz, H2-17), 4,10 (2H, dd, J = 5,6, 2,8 Hz, H2-1ʹ), 2,38 (1H, ddd, J = 13,0, 4,4, 2,4 Hz , H2-7), 2,26 (1H, dd, J = 10,0, 4,0 Hz, H2-12), 2,23 (1H, t, J = 2,8 Hz, H-3ʹ), 2,16 (3H, d, J = 1,2 Hz , H3-16), 1,97 (1H, dd, J = 13,0, 5,0 Hz, H2-7), 1,91 (1H, m, H2-12), 1,75 (1H, m, H2-1), 1,71 (1H, m, H2-6), 1,64 (1H, m, H2-11), 1,58 (1H, m, H2-2), 1,55 (1H, m, H-9), 1,49 (1H, m, H2-2) , 1,45 (1H, m, H-11), 1,39 (1H, m, H2-3), 1,32 (1H, dd, J = 13,0, 4,4 Hz, H2-6), 1,17 (1H, td, J = 13,0 , 4,4 Hz, H2-3), 1,08 (1H, dd, J = 13,0, 2,8 Hz, H-5), 1,00 (1H, td, J = 13,0, 4,4 Hz, H2-1), 0,87 (3H, s , H3-18), 0,80 (3H, s, H3-19), 0,68 (3H, s, H3-20). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ 166,6 (C-15, s), 156,9 (C-13, s), 148,4 (C-8, s), 116,8 (C-14, d), 106,3 (C-17 , t), 79,9 (C-2ʹ, s), 71,4 (C-3ʹ, d), 56,0 (C-9, d), 55,4 (C-5, d), 42,1 (C-3, t), 39,66 (C-10, s), 39,65 (C-12, t), 39,0 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,59 (C-18, q), 33,57 (C-4, s), 28,9 (C-1ʹ, t), 24,4 (C-6, t), 21,7 (C-19, q), 21,5 (C-11, t), 19,4 (C-2, t), 18,4 ( C-16, q), 14,5 (C-20, q). EM ESI-TOF: calculado para C23H36NO, m/z 342,2791 [M + H]+, encontrado 342,2794.

El residuo bruto se preabsorbió en gel de sílice y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna de gel de sílice usando una mezcla de EtOAc:hexano (10:90) como eluyente para proporcionar 4d (26,9 mg, rendimiento del 80 %) como un aceite amarillo. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{26}\) ​​+28,2 (c 2,51, CHCl3); FTIR (puro) Ѵmáx: 3293, 3078, 2924, 2851, 1659, 1628, 1542, 1459, 1441, 1387, 1365, 1259, 887 cm‒1. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 5,5 (1H, d, J = 1,2 Hz, H-14), 5,39 (1H, s, NH), 4,83 (1H, d, J = 1,5 Hz, H2-17) , 4,49 (1H, d, J = 1,2 Hz, H2-17), 3,27 (2H, m, H2-1ʹ), 2,38 (1H, ddd, J = 12,0, 4,4, 2,4 Hz, H2-7), 2,23 ( 1H, ddd, J = 12,0, 10,0, 4,0 Hz, H2-12), 2,14 (3H, d, J = 1,2 Hz, H3-16), 1,97 (1H, m, H2-7), 1,90 (1H, m , H2-12), 1,76 (1H, m, H2-1), 1,72 (1H, m, H2-6), 1,65 (1H, m, H2-11), 1,58 (1H, m, H2-2), 1,56 (1H, m, H-9), 1,53‒1,47 (2H, m, H-2'), 1,49 (2H, m, H2-2/H2-2ʹ), 1,45 (1H, m, H2-11) , 1,39 (1H, m, H2-3), 1,33 (1H, m, H2-6), 1,32‒1,25 (10H, m, H-3ʹ/H-4ʹ/ H-5ʹ/H-6ʹ/H-7ʹ ), 1,17 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H-3), 1,08 (1H, dd, J = 13,0, 4,0 Hz, H-5), 1,01 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz , H-1), 0,88 (3H, m, H3-8ʹ), 0,87 (3H, s, H3-18), 0,80 (3H, s, H3-19), 0,68 (3H, s, H3-20). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ 167,2 (C-15, s), 154,7 (C-13, s), 148,5 (C-8, s), 117,9 (C-14, d), 106,3 (C-17 , t), 56,1 (C-9, d), 55,5 (C-5, d), 42,1 (C-3, t), 39,7 (C-10, s), 39,6 (C-12, t), 39,2 (C-1ʹ, t), 39.0 (C-1, t), 38.3 (C-7, t), 33.6 (C-18, q), 33.58 (C-4, s), 31.8 (C-6ʹ, t), 29,8 (C-2ʹ, t), 29,3 (C-4ʹ, t), 29,2 (C-5ʹ, t), 27,0 (C-3ʹ, t), 24,5 (C-6, t), 22,6 ( C-7ʹ, t), 21,7 (C-19, q), 21,5 (C-11), 19,3 (C-2), 18,3 (C-16, q), 14,5 (C-20, q), 14,1 ( C-8`, q). EM ESI-TOF: calculado para C28H49NNaO, m/z 438,3706 [M + Na]+, encontrado 438,3695.

El residuo bruto se preabsorbió en gel de sílice y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna de gel de sílice usando una mezcla de EtOAc:hexano (5:95) como eluyente para proporcionar 4e (16,7 mg, rendimiento del 54 %) como un aceite amarillo. ({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{25}\) +35,2 (c 0,69, CHCl3); FTIR (puro) Ѵmax: 3308, 2927, 2845, 1661, 1641, 1598, 1541, 1499, 1440, 1387, 1309, 1252, 1152, 1079, 888, 752, 691 cm‒1. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,55 (1H, d, J = 7,6 Hz, H-2ʹ), 7,32 (3H, m, H-3ʹ/H-4ʹ/H-5ʹ), 7,08 (1H, br t , J = 7,6 Hz, H-6ʹ), 5,66 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-14), 4,82 (1H, d, J = 1,1 Hz, H2-17), 4,52 (1H, br s, H2-17), 2,40 (1H, ddd, J = 13,0, 4,4, 2,4 Hz, H2-7), 2,27 (1H, ddd, J = 13,0, 10,4, 1,2 Hz, H2-12), 2,22 (3H, d , J = 1,2 Hz, H3-16), 1,98 (1H, m, H2-7), 1,95 (1H, m, H2-12), 1,76 (1H, m, H2-1), 1,74 (1H, m, H2-6), 1,71 (1H, m, H2-11), 1,61 (1H, m, H2-2), 1,58 (1H, m, H-9), 1,53 (1H, m, H2-2), 1,48 (1H, m, H2-11), 1,40 (1H, m, H2-3), 1,33 (1H, dd, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-6), 1,18 (1H, td, J = 13,0, 4,4 Hz, H2-3), 1,10 (1H, dd, J = 12,4, 3,0 Hz, H-5), 1,02 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-1), 0,88 (3H, s, H3 -18), 0,80 (3H, s, H3-19), 0,70 (3H, s, H3-20). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δC 165,0 (C-15, s), 157,9 (C-13, s), 148,5 (C-8, s), 138,3 (C-1ʹ, s), 129,0 (C-4ʹ , d), 124.0 (C-3ʹ/C-5ʹ, d), 119.7 (C-2ʹ/C-6ʹ, d), 117.9 (C-14, d), 106.4 (C-17), 56.1 (C- 9, d), 55,5 (C-5, d), 42,1 (C-3, t), 39,9 (C-12, t), 39,7 (C-10, s), 39,1 (C-1, t), 38,4 (C-7, t), 33,6 (C-18, q), 33,6 (C-4, s), 24,5 (C-6, t), 21,7 (C-19, q), 21,5 (C-11 , t), 19,4 (C-2, t), 18,6 (C-16, q), 14,5 (C-20, q); ESI MS: Calculado para C26H37NNaO, m/z 402,2767 [M + Na]+, encontrado 402,2779.

El residuo bruto se preabsorbió en gel de sílice y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna de gel de sílice usando una mezcla de EtOAc:hexano (10:90) como eluyente para proporcionar 4f (30,7 mg, rendimiento del 97 %) como un aceite amarillo. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{25}\) +31,0 (c 0,70, CHCl3); FTIR (puro) Ѵmáx: 3295, 2925, 2843, 1657, 1631, 1536, 1454, 1387, 1365, 1255, 1175, 887, 697 cm‒1. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,31‒7,27 (5H, m, H-2ʹ/H-3ʹ/H-4ʹ/H-5ʹ/H-6ʹ), 5,63 (1H, br s, NH), 5,53 ( 1H, d, J = 1,1 Hz, H-14), 4,83 (1H, d, J = 1,4 Hz, H2-17), 4,48 (1H, s, H2-17), 4,47 (2H, m, H2-7ʹ ), 2,36 (1H, ddd, J = 13,0, 4,4, 2,4 Hz, H2-7), 2,24 (1H, ddd, J = 13,0, 10,4, 1,2 Hz, H2-12), 2,18 (3H, d, J = 1,1 Hz, H3-16), 1,96 (1H, m, H2-7), 1,89 (1H, m, H2-12), 1,75 (1H, m, H2-1), 1,71 (1H, m, H2-6 ), 1,65 (1H, m, H2-11), 1,59 (1H, m, H2-2), 1,56 (1H, m, H-9), 1,49 (1H, m, H2-2), 1,44 (1H, m, H2-11), 1,39 (1H, m, H2-3), 1,31 (1H, dd, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-6), 1,17 (1H, td, J = 13,0, 4,4 Hz, H2 -3), 1,08 (1H, dd, J = 12,4, 3,0 Hz, H-5), 1,00 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-1), 0,87 (3H, s, H3-18) , 0,80 (3H, s, H3-19), 0,67 (3H, s, H3-20). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ 167,9 (C-15, s), 156,9 (C-13, s), 149,4 (C-8, s), 139,5 (C-1ʹ, s), 129,5 (C-3ʹ /C-5ʹ, d), 128,7 (C-2ʹ/C-6ʹ, d), 128,2 (C-4ʹ, d), 118,2 (C-14, d), 107,0 (C-17, t), 56,5 ( C-9, d), 55,8 (C-5, d), 43,6 (C-7ʹ, t), 42,4 (C-3, t), 39,99 (C-10, s), 39,90 (C-12, t ), 39,3 (C-1, t), 38,6 (C-7, t), 33,8 (C-4, s), 33,8 (C-18, q), 24,6 (C-6, t), 21,9 (C -19, q), 21,7 (C-11, t), 19,5 (C-2, t), 18,6 (C-16, q), 14,6 (C-20, q). EM ESI-TOF: calculado para C27H39NNaO, m/z 416,2924 [M + Na]+, encontrado 416,2940.

El residuo bruto se preabsorbió en gel de sílice y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna de gel de sílice usando una mezcla de EtOAc:hexano (20:80) como eluyente para proporcionar 4 g (29,1 mg, rendimiento del 91 %) en forma de un aceite amarillo. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{27}\) +33,3 (c 0,71, CHCl3); FTIR (puro) Ѵmax: 3312, 3077, 2925, 2866, 2843, 1661, 1641, 1599, 1571, 1524, 1459, 1437, 1387, 1365, 1234, 1153, 887, 750, 692 centímetros‒1. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,54 (1H, ddd, J = 4,0, 1,6, 0,4 Hz, H-6ʹ), 7,67 (1H, td, J = 8,0, 2,0 Hz, H-4ʹ), 7,30 (1H , d, J = 8,0 Hz, H-3ʹ), 7,20 (1H, ddd, J = 4,0, 1,6, 0,8 Hz, H-5ʹ), 6,60 (1H, br s, NH), 5,65 (1H, br d, J = 1,3 Hz, H-14), 4,84, d, J = 1,6 Hz, H2-17), 4,61 (1H, br s, H2-7ʹ), 4,60 (1H, br s, H2-7ʹ), 4,50 ( 1H, d, J = 1,2 Hz, H2-17), 2,38 (1H, ddd, J = 13,0, 4,4, 2,4 Hz, H2-7), 2,26 (1H, ddd, J = 16,0, 10,4, 1,2 Hz, H2 -12), 2,17 (3H, d, J = 1,2 Hz, H3-16), 1,98 (1H, dd, J = 13,0, 2,4 Hz, H2-7), 1,91 (1H, m, H2-12), 1,74 (1H, m, H2-1), 1,71 (1H, m, H2-6), 1,66 (1H, m, H2-11), 1,58 (1H, m, H2-2), 1,56 (1H, m, H -9), 1,50 (1H, m, H2-2), 1,46 (1H, m, H2-11), 1,39 (1H, m, H2-3), 1,32 (1H, dd, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-6), 1,17 (1H, td, J = 13,0, 4,4 Hz, H2-3), 1,09 (1H, dd, J = 12,4, 3,0 Hz, H-5), 1,01 (1H, td, J = 13,0 , 5,0 Hz, H2-1), 0,87 (3H, s, H3-18), 0,80 (3H, s, H3-19), 0,68 (3H, s, H3-20). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ 167,2 (C-15, s), 156,8 (C-2ʹ, s), 155,6 (C-13, s), 149,0 (C-6ʹ, d), 148,5 (C-8 , s), 136,8 (C-4ʹ, d), 122,31 (C-3ʹ, d) 122,24 (C-5ʹ, d), 117,6 (C-14, d), 106,3 (C-17, t), 56,1 ( C-9, d), 55,5 (C-5), 44,3 (C-7ʹ, d), 42,1 (C-3, t), 39,7 (C-10, s), 39,7 (C-12, t), 39,1 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,6 (C-4, s), 33,6 (C-18, q), 24,5 (C-6, t), 21,7 (C-19 , q), 21,5 (C-11, t), 19,4 (C-2, t), 18,4 (C-16, q), 14,5 (C-20, q). EM ESI-TOF: calculado para C26H38N2NaO, m/z 417,2876 [M + Na]+, encontrado 417,2893.

El residuo bruto se preabsorbió en gel de sílice y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna de gel de sílice usando una mezcla de EtOAc:hexano (20:80) como eluyente para proporcionar 4 h (33 mg, rendimiento del 91 %) en forma de un aceite amarillo. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{25}\) +26,2 (c 2,21, CHCl3); FTIR (puro) Ѵmáx: 3299, 2928, 2845, 1689, 1641, 1521, 1457, 1440, 1387, 1365, 1254, 1230, 887, 740 cm‒1. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,30 (1H, br s, NH-triptamina), 7,61 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-7ʹ triptamina), 7,37 (1H, d, J = 8,0 Hz, H -4ʹ triptamina), 7,21 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-5ʹ triptamina), 7,11 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-6ʹ triptamina), 7,03 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2ʹ triptamina), 5,49 (1H, br s, NH), 5,43 (1H, br s, H-14), 4,81 (1H, d, J = 1,2 Hz, H2-17), 4,47 (1H, br s , H2-17), 3,63 (2H, ddd, J = 7,0, 5,0, 2,0 Hz, H2-α triptamina), 2,99 (2H, t, J = 7,0 Hz, H2-β triptamina), 2,37 (1H, ddd, J = 13,0, 4,0, 3,0 Hz, H2-7), 2,20 (1H, ddd, J = 13,0, 10,0, 4,0 Hz, H2-12), 2,14 (3H, d, J = 0,8 Hz, H3-16), 1,95 (1H, m, H2-7), 1,86 (1H, m, H2-12), 1,74 (1H, m, H2-1), 1,70 (1H, m, H2-6), 1,63 (2H, m, H2-11), 1,57 (1H, m, H2-2), 1,54 (1H, m, H-9), 1,48 (1H, m, H2-2), 1,43 (1H, m, H2-11), 1,38 (1H, m, H2-3), 1,31 (1H, dd, J = 13,0, 4,4 Hz, H2-6), 1,16 (1H, td, J = 12,0, 4,1 Hz, H2-3), 1,07 (1H, dd, J = 12,0, 2,4 Hz, H-5), 0,99 (1H, td, J = 12,0, 4,0 Hz, H2-1), 0,87 (3H, s, H3-18), 0,80 (3H, s, H3 -19), 0,67 (3H, s, H3-20); RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ 167,2 (C-15, s), 155,0 (C-13, s), 148,6 (C-8, s), 136,4 (C-7ʹa, s), 127,4 (C-3ʹa , s), 122,1 (C-2ʹ, d), 122,1 (C-6ʹ, d), 119,4 (C-5ʹ, d), 118,9 (C-7ʹ, d), 117,8 (C-14, d), 113,1 (C-3ʹ, s), 111,3 (C-4', d), 106,3 (C-17, t), 56,1 (C-9, d), 55,4 (C-5, d), 42,1 (C-3 , t), 39,7 (C-10, s), 39,6 (C-12, t), 39,4 (C-α, d), 39,0 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,59 (C-18, q), 33,57 (C-4, s), 25,5 (C-β, t), 24,2 (C-6, t), 21,7 (C-19, q), 21,5 (C-11, d), 19,4 (C-2), 18,3 (C-16, q), 14,4 (C-20, q); EM ESI-TOF: calculado para C30H42N2NaO, m/z 469,3189 [M + Na]+, encontrado 469,3197.

El residuo bruto se preabsorbió en gel de sílice y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna de gel de sílice usando una mezcla de EtOAc:hexano (20:80) como eluyente para proporcionar 4i (19 mg, rendimiento del 71 %) como un aceite amarillo. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{27}\) +37,5 (c 1,54, CHCl3); FTIR (puro) Ѵmáx: 3176, 2931, 2843, 1638, 1507, 1459, 1440, 1387, 1366, 1255, 1201, 1076, 1048, 887, 788 cm‒1. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 5,50 (1H, s, H-14), 4,84 (1H, d, J = 1,2 Hz, H2-17), 4,49 (1H, s, H2-17), 3,77 ( 3H, s, OCH3), 2,38 (1H, ddd, J = 12,0, 4,4, 2,4 Hz, H2-7), 2,27 (1H, ddd, J = 13,0, 10,0, 4,4 Hz, H2-12), 2,17 (3H , d, J = 1,1 Hz, H3-16), 1,98 (1H, m, H2-7), 1,94 (1H, m, H2-12), 1,75 (1H, m, H2-1), 1,71 (1H, m, H2-6), 1,65 (1H, m, H2-11), 1,59 (1H, m, H2-2), 1,56 (1H, m, H-9), 1,49 (1H, m, H-2) , 1,48 (1H, m, H2-11), 1,39 (1H, m, H2-3), 1,32 (1H, dd, J = 13,0, 4,2 Hz, H2-6), 1,17 (1H, td, J = 13,0 , 4,0 Hz, H2-3), 1,09 (1H, dd, J = 12,0, 2,4 Hz, H-5), 1,01 (1H, td, J = 12,8, 4,0 Hz, H2-1), 0,87 (3H, s , H3-18), 0,80 (3H, s,H3-19), 0,68 (3H, s, H3-20); RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ 171,0 (C-15, s), 148,4 (C-13/C-8, s), 113,0 (C-14, d), 106,3 (C-17, t), 64,7 (OCH3, q), 56,1 (C-9, d), 55,5 (C-5, d), 42,1 (C-3, t), 39,9 (C-10, s), 39,7 (C-12, t) , 39,1 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,6 (C-18, s), 33,59 (C-4, s), 24,4 (C-6, t), 21,7 (C- 19, s), 21,5 (C-11, t), 19,4 (C-2, t), 18,8 (C-16, s), 14,5 (C-20, s); EM ESI-TOF: calculado para C21H35NNaO2, m/z 356,2560 [M + Na]+, encontrado 356,2565.

El residuo bruto se preabsorbió en gel de sílice y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna de gel de sílice usando una mezcla de EtOAc:hexano (40:80) como eluyente para proporcionar 4j (4,7 mg, 20 % de rendimiento) como un aceite amarillo. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{26}\) ​​+33,5 (c 0,55, CHCl3); FTIR (puro) Ѵmáx: 3212, 2925, 2843, 1641, 1459, 1442, 1387, 1366, 1087, 1031, 887, 861, 738 cm‒1; RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ 5,45 (1H, sa, H-14), 4,84 (1H, d, J = 1,3 Hz, H2-17), 4,47 (1H, sa, H2-17), 2,38 (1H, ddd, J = 13,0, 4,0, 2,0 Hz, H2-7), 2,27 (1H, ddd, J = 14,0, 10,0, 5,0 Hz, H2-12), 2,18 (3H, br s, H3-16) , 1,97 (1H, m, H-7), 1,93 (1H, m, H2-12), 1,75 (1H, m, H2-1), 1,71 (1H, m, H2-6), 1,65 (1H, m , H2-11), 1,58 (1H, m, H2-2), 1,55 (1H, m, H-9), 1,50 (1H, m, H2-2), 1,46 (1H, m, H2-11), 1,39 (1H, m, H2-3), 1,32 (1H, dd, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-6), 1,17 (1H, td, J = 13,3, 4,0 Hz, H2-3), 1,08 (1H , dd, J = 10,0, 3,0 Hz, H-5), 1,00 (1H, td, J = 12,0, 4,0 Hz, H2-1), 0,87 (3H, s, H3-18), 0,80 (3H, s, H3-19), 0,68 (3H, s, H3-20); RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ 166,5 (C-15, s), 158,7 (C-13, s), 148,3 (C-8, s), 112,3 (C-14, d), 106,4 (C-17 , t), 56,0 (C-9, d), 55,5 (C-5, d), 42,1 (C-3, t), 39,72 (C-12, t), 39,70 (C-10, s), 39,1 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,6 (C-18, q), 33,6 (C, C-4, s), 24,4 (C-6, t), 22,6 (C- 19, q), 21,7 (C-11, t), 19,3 (C-16, q), 18,9 (C-2, t), 14,5 (C-20, q); ESI-TOF MS: calculado para C20H34NO2, m/z 320,2584 [M + H]+, encontrado 320,2583.

El residuo bruto se preabsorbió en gel de sílice y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna de gel de sílice usando una mezcla de EtOAc:hexano (20:80) como eluyente para proporcionar 4k (9,8 mg, rendimiento del 40 %) como un aceite amarillo. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{27}\) +35,5 (c 1,16, CHCl3); FTIR (puro) Ѵmáx: 3240, 2924, 2865, 2844, 1655, 1624, 1542, 1458, 1440, 1386, 1365, 1289, 1194, 1006, 887, 851, 685 cm‒1; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 5,48 (1H, s, H-14), 4,84 (1H, d, J = 1,3 Hz, H2-17), 4,47 (1H, s, H2-17), 2,38 ( 1H, ddd, J = 13,0, 4,0, 2,0 Hz, H2-7), 2,27 (1H, ddd, J = 14,0, 10,0, 5,0 Hz, H2-12), 2,18 (3H, br s, H3-16), 1,97 (1H, m, H-7), 1,93 (1H, m, H2-12), 1,75 (1H, m, H2-1), 1,71 (1H, m, H2-6), 1,65 (1H, m, H2-11), 1,58 (1H, m, H2-2), 1,55 (1H, m, H-9), 1,50 (1H, m, H2-2), 1,46 (1H, m, H2-11), 1,39 (1H, m, H2-3), 1,32 (1H, dd, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-6), 1,17 (1H, td, J = 13,3, 4,0 Hz, H2-3), 1,08 (1H, dd, J = 10,0, 3,0 Hz, H-5), 1,00 (1H, td, J = 12,0, 4,0 Hz, H2-1), 0,87 (3H, s, H3-18), 0,80 (3H, s, H3 -19), 0,68 (3H, s, H3-20); RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ 163,0 (C-15, s), 157,1 (C-13, s), 148,4 (C-8, s) , 114,6 (C-14, d), 106,3 (C-17, t), 56,0 (C-9, d), 55,5 (C-5, d), 42,1 (C-3, t), 39,67 (C- 10, s), 39,6 (C-12, t), 39,0 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,59 (C-18, q), 33,58 (C-4, s), 21,7 (C-19, q), 21,6 (C-11, t), 19,4 (C-16, q), 18,6 (C-2, t), 14,5 (C-20, q); EM ESI-TOF: calculado para C20H34N2O, m/z 341,2563 [M + H]+, encontrado 341,2553.

El residuo bruto se preabsorbió en gel de sílice y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna de gel de sílice usando una mezcla de EtOAc:hexano (10:90) como eluyente para proporcionar 4 litros (22,9 mg, rendimiento del 74 %) en forma de un aceite amarillo. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{25}\) +11,8 (c 1,06 CHCl3); FTIR (puro) Ѵmax: 3197, 2925, 2849, 1661, 1642, 1456, 1441, 1387, 1365, 1257, 1204, 1113, 1037, 1064, 1021, 951, 895, 875, 817 cm ‒1. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 5,49 (1H, s, H-14), 4,94 (1H, s, H-1ʹ), 4,82 (1H, s, H2-17), 4,47 (1H, s, H2-17), 3,95 (1H, t, J = 9,0 Hz, H2-5ʹ), 3,63 (1H, m, H2-5ʹ), 2,37 (1H, ddd, J = 13,0, 4,0, 2,4 Hz, H2 -7), 2,25 (1H, ddd, J = 14,0, 10,1, 4 Hz, H2-12), 2,15 (3H, d, J = 1,0 Hz, H3-16), 1,97 (1H, m, H2-7) , 1,93 (1H, m, H2-12), 1,81 (2H, m, H2-2ʹ/H2-3ʹ), 1,74 (1H, m, H2-1), 1,71 (1H, m, H2-6), 1,65 (1H, m, H2-11), 1,63 (1H, m, H2-4ʹ), 1,58–1,53 (2H, m, H2-3ʹ/H2-4ʹ), 1,58 (1H, m, H2-2), 1,54 (1H, m, H-9), 1,48 (1H, m, H2-2), 1,46 (1H, m, H2-11), 1,38 (1H, m, H2-3), 1,30 (1H, dd, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-6), 1,16 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-3), 1,07 (1H, dt, J = 12,0, 2,0 Hz, H-5), 0,99 (1H , br t, J = 12,0 Hz, H2-1), 0,86 (3H, s, H3-18), 0,79 (3H, s, H3-19), 0,67 (3H, s, H3-20); RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ 158,0 (C-15, s), 158,0 (C-13, s), 148,4 (C-8, s), 148,4 (C-13, s), 113,2 (C-14 , d), 106,3 (C-17, t), 102,6 (C-1ʹ, d), 62,6 (C-5ʹ, t), 56,0 (C-9, d), 55,4 (C-5, d), 42,0 (C-3, t), 39,8 (C-10, s), 39,6 (C-12, t), 39,0 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,6 (C-18, q), 33,6 (C-4, s), 28,1 (C-2ʹ, t), 25,0 (C-4ʹ, t), 24,4 (C-6, t), 21,7 (C-19, q), 21,4 ( C-11, t), 19,3 (C-2, t), 18,67 (C-3ʹ, t), 18,66 (C-16, q), 14,4 (C-20, q). EM ESI-TOF: calculado para C25H41NNaO3, m/z 426,2979 [M + Na]+, encontrado 426,2969.

El residuo bruto se preabsorbió en gel de sílice y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna de gel de sílice usando una mezcla de CH2Cl2:MeOH (98:2) como eluyente para proporcionar 4 m (22,6 mg, rendimiento del 85 %) en forma de un aceite amarillo. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{27}\) +31,9 (c 2,11, CHCl3); FTIR (puro) Ѵmáx: 2925, 2848, 1651, 1629, 1458, 1442, 1388, 1371, 1265, 1131, 1056, 887, 852 cm‒1. RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ 5,76 (1H, d, J = 0,8 Hz, H-14), 4,84 (1H, d, J = 1,6 Hz, H2-17), 4,50 (1H, d, J = 1,2 Hz, H2-17), 3,02 (3H, s, H3-1ʹʹ), 2,98 (3H, s, H3-1ʹ), 2,39 (1H, ddd, J = 13,0 4,4, 2,4 Hz, H2-7), 2,24 ( 1H, ddd, J = 13,0, 10,0, 4,0 Hz, H2-12), 1,97 (1H, m, H2-7), 1,93 (1H, m, H2-12), 1,90 (3H, d, J = 1,2 Hz , H3-16), 1,75 (1H, m, H2-1), 1,71 (1H, m, H2-7), 1,65 (1H, m, H2-11), 1,58 (1H, m, H-9), 1,50 1,58 (1H, m, H-9), 1,55 (1H, m, H2-2), 1,50 (1H, m, H2-2), 1,48 (1H, m, H2-11), 1,39 (1H, m , H2-3), 1,33 (1H, dd, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-6), 1,17 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-3), 1,08 (1H, dd, J = 12,0, 3,0 Hz, H-5), 1,01 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-1), 0,87 (3H, s, H3-18), 0,80 (3H, s, H3-19), 0,68 (3H, s, H3-20). RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ 168,8 (C-15, s), 149,9 (C-13, s), 148,5 (C-8, s), 117,4 (C-14, d), 106,3 (C-17 , t), 56,1 (C-9, d), 55,5 (C-5, d), 42,1 (C-3, t), 39,7 (C-10, s), 39,1 (C-1, t), 38,6 (C-12, t), 38.3 (C-7, t), 37.8 (C-1ʹʹ, q), 34.7 (C-1ʹ, q), 33.61 (C-18, q), 33.58 (C-4, s), 24,4 (C-6, t), 21,7 (C-19, q), 21,4 (C-11, t), 19,4 (C-2, t), 18,5 (C-16, q), 14,5 ( C-20, q); EM ESI-TOF: calculado para C22H38NO, m/z 322,2948 [M + H]+, encontrado 332,2949.

El residuo bruto se preabsorbió en gel de sílice y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna de gel de sílice usando una mezcla de CH2Cl2:MeOH (99:1) como eluyente para proporcionar 4n (20,3 mg, rendimiento del 68 %) como un aceite amarillo. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{27}\) +24,9 (c 2,08, CHCl3); FTIR (puro) Ѵmáx: 3077, 2932, 2848, 1626, 1440, 1381, 1255, 1228, 1137, 1124, 1021, 886, 850 cm‒1. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 5,72 (1H, d, J = 0,8 Hz, H-14), 4,84 (1H, d, J = 1,6 Hz, H2-17), 4,51 (1H, br s, H2- 17), 3,59 (1H, m, H2-a), 3,45 (1H, m, H2-a), 2,39 (1H, ddd, J = 13,0, 4,0, 2,4 Hz, H2-7), 2,22 (1H, ddd , J = 14,0, 9,5, 4,3 Hz, H2-7), 1,94 (2H, m, H2-12), 1,83 (3H, s, H3-16), 1,76 (1H, m, H2-1), 1,71 (1H, m, H2-c), 1,65 (1H, m, H2-11), 1,63 (1H, m, H2-6), 1,61 (1H, m, H2-b), 1,58 (2H, m, H2 -c/H-9), 1,55 (1H, m, H2-2), 1,53 (1H, m, H2-b), 1,52 (1H, m, H2-b), 1,49 (1H, m, H2-2 ), 1,47 (2H, m, H2-11), 1,39 (1H, br d, J = 13,0 Hz, H2-3), 1,32 (1H, dd, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-6), 1,17 ( 1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-3), 1,07 (1H, dd, J = 13,0, 2,4 Hz, H-5), 1,00 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-1 ), 0,87 (3H, s, H3-18), 0,80 (3H, s, H3-19), 0,69 (3H, s, H3-20); RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ 167,5 (C-15, s), 148,4 (C-8, s), 147,9 (C-13, s), 118,1 (C-14, d), 106,4 (C-17 , t), 56,1 (C-9, d), 55,6 (C-5, d), 47,4 (Ca de piperidina, t), 42,21 (Ca de piperidina, t), 42,16 (C-3, t), 39,7 (C-10, s), 39,1 (C-1, t), 38,4 (C-12, t), 38,2 (C-7, t), 33,64 (C-18, q), 33,58 (C-4, s), 26,7 (Cb de piperidina, t), 25,7 (Cb de piperidina, t), 24,7 (Cc de piperidina, t), 24,5 (C-6, t), 21,7 (C-19, q), 21,3 ( C-11,t), 19,4 (C-2,t), 18,5 (C-16,q), 14,5 (C-20,q); EM ESI-TOF: calculado para C25H41NNaO, m/z 394,3080 [M + Na]+, encontrado 394,3070.

El residuo bruto se preabsorbió en gel de sílice y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna de gel de sílice usando una mezcla de CH2Cl2:MeOH (99:1) como eluyente para proporcionar 4o (29,4 mg, rendimiento cuantitativo) como un aceite incoloro. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{27}\) +29,6 (c 2,61, CHCl3); FTIR (puro) Ѵmáx: 2933, 2844, 1656, 1634, 1458, 1441, 1387, 1366, 1319, 1175, 1003, 887 cm‒1; RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ 6,08 (1H, s, H-14), 4,86 ​​(1H, s, H2-17), 4,53 (1H, s, H2-17), 3,68 (3H, s, OCH3), 3,20 (3H, s, H3-1ʹ), 2,40 (1H, ddd, J = 12,0, 4,0, 3,0 Hz, H2-7), 2,30 (1H, ddd, J = 14,0, 9,0, 4,0 Hz, H2 -12), 2,13 (3H, d, J = 1,1 Hz, H3-16), 2,06–1,91 (2H, m, H2-7/H2-12), 1,78 (1H, m, H2-1), 1,74 ( 1H, m, H2-11), 1,65 (1H, m, H2-2), 1,56 (1H, m, H-9), 1,50 (1H, m, H2-2), 1,47 (1H, m, H2- 11), 1,40 (1H, m, H2-3), 1,33 (1H, dd, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-6), 1,20 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-3), 1,10 (1H, dd, J = 12,0, 2,0 Hz, H-5), 1,01 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-1), 0,88 (3H, s, H3-18), 0,81 (3H , s, H3-19), 0,70 (3H, s, H3-20); RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ 168,3 (C-15, s), 157,2 (C-13, s), 148,4 (C-8, s), 113,7 (C-14, d), 106,3 (C-17 , t), 61,4 (OCH3, q), 56,0 (C-9, d), 55,5 (C-5, d), 42,1 (C-3, t), 40,0 (C-12, t), 39,7 (C -10, s), 39,0 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,59 (C-18, q), 33,57 (C-4, s), 32,0 (C-1ʹ, q) , 24,5 (C-6, t), 21,7 (C-19, q), 21,6 (C-11, t), 19,4 (C-2, t), 18,7 (C-16, q), 14,5 (C- 20,q); EM ESI-TOF: calculado para C22H37NNaO2, m/z 370,2717 [M + Na]+, encontrado 370,2741.

El residuo bruto se preabsorbió en gel de sílice y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna de gel de sílice usando una mezcla de CH2Cl2:MeOH (99:1) como eluyente para proporcionar 4p (27,5 mg, rendimiento del 51 %) como un aceite amarillo. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{27}\) +38,8 (c 0,42, CHCl3); FTIR (puro) Ѵmax:3170, 3078, 2926, 2843, 1764, 1687, 1643, 1597, 1440, 1387, 1201, 1110, 965, 886, 742 cm‒1. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 5,73 (1H, s, NH), 5,68 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-14), 4,85 (1H, d, J = 1,4 Hz, H2-17) , 4,50 (1H, s, H2-17), 3,35 (3H, s, H3-1ʹ), 2,39 (1H, ddd, J = 13,0, 4,4, 2,4 Hz, H2-7), 2,28 (H, ddd, J = 12,0, 10,0, 4,0 Hz, H2-12), 2,04 (3H, s, H3-16), 1,98 (1H, m, H2-12), 1,94 (1H, m, H2-7), 1,75 (1H, m, H2-1), 1,73 (1H, m, H2-6), 1,66 (1H, m, H2-11), 1,60 (1H, m, H2-2). 1,56 (1H, m, H-9), 1,50 (H, m, H2-2), 1,47 (1H, m, H2-11), 1,39 (1H, m, H2-3), 1,33 (1H, dd, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-6), 1,18 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-3), 1,09 (1H, dd, J = 12,0, 4,0 Hz, H-5), 1,01 ( 1H, td, J = 13,0, 4 Hz, H2-1), 0,87 (3H, s, H3-18), 0,80 (3H, s, H3-19), 0,68 (3H, s, H3-20); RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ 163,5 (C-15, s), 148,4 (C-13/C-8, s), 114,9 (C-14, d), 106,4 (C-17, t), 56,1 (C-9, d), 55,5 (C-5, d), 42,1 (C-3, t), 40,0 (C-10, s), 39,7 (C-12, t), 39,1 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 36,3 (C-1ʹ, q), 33,6 (C-18, q), 33,59 (C-4, s), 24,5 (C-6, t), 21,7 ( C-19, q), 21,5 (C-11, t), 19,4 (C-2, t), 18,7 (C-16, q), 14,5 (C-20, q). ESI-TOF MS: calculado para C21H35NNaO2, m/z 356,2560 [M–H]+, encontrado 356,2564.

El residuo bruto se preabsorbió en gel de sílice y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna de gel de sílice usando una mezcla de EtOAc:hexano (10:90) como eluyente para proporcionar 4q (22,3 mg, rendimiento del 74 %) como un aceite amarillo. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{26}\) ​​+ 29,0 (c 0,88, CHCl3); FTIR (puro) Ѵmáx: 3314, 2928, 2865, 2844, 1754, 1661, 1638, 1638, 1532, 1438, 1366, 1205, 1175, 887 cm‒1; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 5,86 (1H, s, NH), 5,59 (1H, s, H-14), 4,84 (1H, d, J = 1,4 Hz, H2-17), 4,49 (1H , d, J = 1,0 Hz, H2-17), 4,10 (2H, d, J = 5,2 Hz, H2-2ʹ), 3,77 (3H, s, OCH3), 2,39 (1H, ddd, J = 12,0, 4,4, 2,4 Hz, H2-7), 2,26 (1H, ddd, J = 12,0, 10,0, 4,0 Hz, H2-12), 2,15 (3H, d, J = 0,8 Hz, H3-16), 1,98 (1H, m, H2-7), 1,92 (1H, m, H2-12), 1,76 (1H, m, H2-1), 1,72 (1H, m, H2-6), 1,65 (1H, m, H2-6), 1,5589 (1H, m, H2-2), 1,56 (1H, m, H-9), 1,50 (1H, m, H2-2), 1,46 (1H, m, H2-11), 1,39 (1H, m, H2 -3), 1,32 (1H, dd, J = 13,0, 4,4 Hz, H2-6), 1,17 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-3), 1,09 (1H, dd, J = 13,0, 3,0 Hz, H-5), 1,01 (1H, td, J = 13,0, 4,4 Hz, H2-1), 0,87 (3H, s, H3-18), 0,80 (3H, s, H3-19), 0,68 ( 3H, s, H3-20); RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ 170,8 (C-1ʹ, s), 167,0 (C-15, s), 156,8 (C-13, s), 148,4 (C-8, s), 116,9 (C-14 , d), 106,3 (C-17, t), 56,1 (C-9, d), 55,4 (C-5, d), 52,3 (OCH3, q), 42,1 (C-3, t), 41,0 (C -2ʹ, t), 39,7 (C-12, t), 39,68 (C-10, s), 39,1 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,6 (C-18, q) , 33,6 (C-4, s), 24,5 (C-6, t), 21,7 (C-19, q), 21,5 (C-11, t), 19,4 (C-2, t), 18,5 ( C-16, q), 14,5 (C-20, q); EM ESI-TOF: calculado para C23H37NNaO3, m/z 398,2666 [M + Na]+, encontrado 398,2660.

El residuo bruto se preabsorbió en gel de sílice y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna de gel de sílice usando una mezcla de CH2Cl2:MeOH (95:5) como eluyente para proporcionar 4r (22,4 mg, rendimiento del 72 %) como un aceite incoloro. ({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{27}\) +30,5 (c 1,41 CHCl3); FTIR (puro) Ѵmax: 3313, 2928, 2844, 1750, 1661, 1638, 1524, 1460, 1443, 1373, 1263, 1195, 1178, 1025, 886, 863, 736 cm‒1; RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δH 5,94 (H, s, NH), 5,60 (H, d, J = 1,0 Hz, H-14), 4,85 (1H, d, J = 1,2 Hz, H2-17) , 4,50 (1H, s, H2-17), 4,23 (2H, q, J = 7,0 Hz, H2-3ʹ), 4,08 (2H, d, J = 5,0 Hz, H2-2ʹ), 2,39 (1H, ddd, J = 13,0, 4,0, 2,0 Hz, H2-7), 2,26 (1H, ddd, J = 13,0, 10,0, 4,0 Hz, H2-12), 2,15 (3H, d, J = 1,0 Hz, H3-16), 1,98 (1H, m, H2-7), 1,94 (1H, m, H2-12), 1,78 (1H, m, H2-1), 1,72 (1H, m, H2-6), 1,68 (1H, m, H2-11), 1,61 (1H, m, H2-2), 1,56 (1H, m, H-9), 1,50 (1H, m, H2-2), 1,48 (1H, m, H2-11), 1,40 (1H, m, H2-3), 1,33 (1H, m, H-6), 1,30 (3H, t, J = 7,0 Hz, H3-4ʹ), 1,21 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-3), 1,10 (1H, dd, J = 12,0, 3,0 Hz, H-5), 0,99 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-1), 0,88 (3H, s, H3-18 ), 0,81 (3H, s, H3-19), 0,69 (3H, s, H3-20); RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δC 170,3 (C-1ʹ, s), 167,0 (C-15, s), 156,5 (C-13, s), 148,4 (C-8, s), 117,0 (C-14 , d), 106,3 (C-17, t), 61,4 (C-3ʹ, t), 56,1 (C-9, d), 55,4 (C-5, d), 42,1 (C-3, t), 41,2 (C-2ʹ, t), 39,68 (C-12, t), 39,65 (C-10, s), 39,0 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,5 (C-18, q), 33,5 (C-4, s), 24,4 (C-6, t), 21,7 (C-19, q), 21,5 (C-11, t), 19,3 (C-2, t), 18,4 ( C-16, q), 14.4 (C-20, q), 14.1 (C-4ʹ, q); EM ESI-TOF: calculado para C24H39NNaO3, m/z 412,2822 [M + Na]+, encontrado 412,2836.

Se disolvió una mezcla de 4r (16,5 mg, 0,04 mmol, 1,0 equiv.) e hidróxido de litio monohidrato (2,1 mg, 0,5 mmol, 1,2 equiv.) en THF:MeOH:H2O (0,4 ml, 0,1 M). La reacción se dejó agitar a temperatura ambiente durante 4 h y luego se eliminaron al vacío el MeOH y el THF. El crudo se diluyó con H2O y se extrajo con EtOAc y la capa orgánica se descartó. La capa acuosa se aciduló hasta pH 3 con una solución de ácido clorhídrico 1 N y luego se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con salmuera, se secaron sobre Mg2SO4(s) y se secaron al vacío para proporcionar 4s (11,7 mg, rendimiento cuantitativo) como un aceite incoloro. El compuesto objetivo se obtuvo como un aceite amarillo con rendimiento cuantitativo. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{25}\) + 20,7 (c 0,83 CHCl3); FTIR (puro) Ѵmáx: 3336, 2926, 2867, 1715, 1662, 1541, 1457, 1441, 1388, 1366, 1261, 1218, 1087, 888, 733 cm‒1; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 6,11 (1H, sr, NH), 5,61 (1H, sr, H-14), 4,84 (1H, sr, H2-17), 4,48 (1H, sr, H2-17), 4,10 (2H, br s, H2-2ʹ), 2,39 (1H, br d, J = 12,0 Hz, H2-7), 2,25 (1H, br d, J = 12,0 Hz, H2-12) , 2,15 (3H, s, H3-16), 1,97 (1H, m, H2-7), 1,91 (1H, m, H2-12), 1,75 (1H, m, H2-1), 1,71 (1H, m , H2-6), 1,65 (1H, m, H2-11), 1,58 (1H, m, H2-2), 1,56 (1H, m, H-9), 1,50 (1H, m, H2-2), 1,45 (1H, m, H2-11), 1,39 (1H, m, H2-3), 1,32 (1H, m, H2-6), 1,17 (1H, m, H2-3), 1,08 (1H, br d , J = 12,0 Hz, H-5), 1,00 (1H, m, H2-1), 0,87 (3H, s, H3-18), 0,80 (3H, s, H3-19), 0,68 (3H, s, H3-20); RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ 172,9 (C-1ʹ, s), 167,9 (C-15, s), 158,0 (C-13, s), 148,4 (C-8, s), 116,5 (C-14 , d), 106,3 (C-17, t), 56,1 (C-9, d), 55,4 (C-5, d), 42,1 (C-3, t), 41,1 (C-2ʹ, t), 39,8 (C-10, s), 39,7 (C-12, t), 39,0 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,6 (C-18, q), 33,6 (C, C- 4, s), 24,4 (C-6, t), 21,7 (C-19, q), 21,5 (C-11, t), 19,4 (C-2, t), 18,6 (C-16, q), 14.5 (C-20,q); ESI-TOF MS: calculado para C22H36NO3, m/z 362,2690 [M + H]+, encontrado 362,2681.

Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (100 µl para células adherentes y 75 µl para células suspendidas) a una densidad de 5000 a 20 000 células por pocillo, dependiendo de sus tasas de crecimiento. Luego se permitió que las células adherentes y suspendidas crecieran a 37 °C con 95% de humedad y 5% de CO2 durante 24 h y 30 min, respectivamente. El ensayo de citotoxicidad se inició añadiendo un volumen igual de medio de cultivo celular que contenía el compuesto probado en concentraciones predeterminadas. Después de 48 h de exposición, la viabilidad celular se determinó mediante el ensayo MTT para células adherentes51,52 o el ensayo XTT para células suspendidas53. Brevemente, para las células adherentes, se agregaron 100 µl del reactivo MTT a cada pocillo y las placas de microtitulación se incubaron adicionalmente durante 2,5 a 4 h. Posteriormente, el medio se reemplazó con 100 µl de DMSO para disolver el formazán púrpura antes de medir la absorbancia a 550 nm usando un lector de microplacas (un SpectraMax Plus 384) con una longitud de onda de referencia de 650 nm. Para las células suspendidas, se agregaron 75 µl del reactivo XTT a cada pocillo y las células se incubaron más durante 4 h. Posteriormente, se midió la absorbancia del formazán naranja a 492 nm con una longitud de onda de referencia de 690 nm utilizando un lector de microplacas. Finalmente se calculó el valor de IC50 a partir de la curva dosis-respuesta como la concentración que inhibe el crecimiento celular en un 50% en comparación con el control negativo después de 48 h de exposición a cada compuesto probado.

Se utilizó doble tinción con anexina V y 7-AAD para distinguir los modos de muerte celular apoptótica y no apoptótica. Brevemente, se sembraron células MDA-MB-231 en placas de cultivo de 6 pocillos a 1 x 106 células/pocillo y se dejaron en una incubadora de CO2 durante 24 h. Posteriormente, las células se trataron con los compuestos probados durante 24 a 48 h. Se utilizó DMSO como vehículo y su concentración final se mantuvo al 0,2% (v/v) durante todo el estudio. Las células tratadas se recolectaron mediante tripsinización y se sometieron a doble tinción con anexina V/7-AAD utilizando el kit Muse® Anexina V y células muertas como se describió anteriormente54. Las células teñidas se analizaron mediante técnica de citometría de flujo utilizando el analizador de células Muse®. La población de células positivas para anexina V se definió como células apoptóticas tempranas, y la población positiva tanto para anexina V como para 7-AAD se definió como células apoptóticas tardías. Los eventos secuenciales de aumento de las poblaciones de células apoptóticas tempranas y tardías a lo largo del tiempo son una característica de la muerte celular apoptótica.

Se trataron células MDA-MB-231 en placas de cultivo de 6 pocillos (1 x 106 células/pocillo) con los compuestos probados durante 24 h. Luego se recogieron las células y se utilizó análisis de transferencia Western para detectar alteraciones de las proteínas diana en las células tratadas, como se describió anteriormente55. Brevemente, las células en placas de cultivo de 6 pocillos se rasparon en tampón de lisis celular RIPA suplementado con un cóctel inhibidor de proteasa/fosfatasa antes de lisarse mediante sonicación. Los lisados ​​​​celulares se centrifugaron a 12.000 xg durante 5 minutos, a 4 ° C, para eliminar los restos celulares. Las proteínas totales (20 μg) en los lisados ​​​​celulares se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con BSA al 3% (p/v) y se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios específicos de las siguientes proteínas: EGFR, fosfo-EGFR (Y845), FAK, fosfo-FAK (Y397), Akt, fosfo -Akt (S473), ERK y fosfo-ERK (T202/Y204). Posteriormente, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante durante 1 hora a temperatura ambiente. Se detectaron bandas de proteínas específicas utilizando sustratos SuperSignal™ ECL y se visualizaron en películas de rayos X.

Se empleó el software iGEMDOCK v2.156 con una configuración de acoplamiento precisa para realizar el acoplamiento molecular para predecir la posible unión entre 4l y FAK. La estructura molecular de 4l se obtuvo en el nivel B3LYP/6-31G* usando Gaussian09. Las estructuras proteicas del dominio FERM (PDB:2AL6) y el dominio quinasa (PDB ID: 2JKK) de FAK se obtuvieron de Protein Data Bank (//www.rcsb.org/). Se utilizó el BIOVIA Discovery Studio Visualizer57 para analizar y obtener imágenes de los resultados del acoplamiento.

Las propiedades de semejanza con los fármacos y la regla de cinco de Lipinski se estudiaron utilizando los servicios del sitio web SwissADME58,59.

El ACP es un diterpenoide labdano que se puede obtener en grandes cantidades a partir de K. elegans. Con su atractiva estructura para usar como punto de partida para la optimización de nuevos agentes bioactivos basados ​​en productos naturales, se sintetizó y evaluó una serie de 21 derivados de ACP para determinar su actividad citotóxica in vitro contra un panel de líneas celulares cancerosas. La ACP y la mayoría de sus derivados mostraron una actividad moderada. Curiosamente, el compuesto 4l demostró una actividad citotóxica notable contra la línea celular MDA-MB-231 de cáncer de mama triple negativo. Un estudio mecanicista adicional reveló que FAK es un objetivo potencial del compuesto 4l en células de cáncer de mama MDA-MB-231, y la inhibición de FAK parecía ser el mecanismo subyacente a la inducción de muerte celular no apoptótica en células tratadas con 4l. Un estudio in-silico sugiere que 4l podría potencialmente inhibir la activación de FAK uniéndose al bolsillo de unión de ATP del dominio quinasa FAK, lo que resultaría en la supresión de la autofosforilación de Tyr397 de FAK. Hasta donde sabemos, este es el primer informe que demuestra la actividad inhibidora de FAK del derivado de ACP. Los datos obtenidos de este trabajo son importantes para un mayor desarrollo de agentes bioactivos basados ​​en productos naturales para el tratamiento del cáncer de mama triple negativo basado en el andamio ACP.

Los datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles en la Información complementaria. Estos incluyeron las películas sin recortar de los resultados de la transferencia Western y los espectros 1H, 13CNMR y MS de los compuestos 1–3 y 4a–4s.

Rahmati, M., Nikmanesh, Y., Abshorshori, N. y Johari, B. Investigación de los efectos citotóxicos y antiproliferativos del trastuzumab en líneas celulares de mama MDA-MB-453 y MDA-MB-468 con diferentes niveles de expresión de HER2 . J. Aplica. Biotecnología. Representante 7, 87–92 (2020).

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Este trabajo de investigación fue financiado en parte por la Investigación Científica e Innovación de Tailandia (TSRI), el Instituto de Investigación Chulabhorn (Subvenciones Nos. 36824/4274394, 36824/4274396 y 36827/4274407) y el Centro de Excelencia en Salud Ambiental y Toxicología (EHT). , OPS, Ministerio de Educación Superior, Ciencia, Investigación e Innovación. PC contó con el apoyo del Royal Golden Jubilee Ph.D. Programa, el Consejo Nacional de Investigación de Tailandia (NRCT5-RGJ63023-176) y la Beca de Posgrado Chulabhorn en conmemoración del 84.º aniversario del cumpleaños de Su Majestad el Rey Bhumibol Adulyadej el Grande. Los autores también desean agradecer al profesor Dr. Wongsatit Chuakul de la Universidad Mahidol por la identificación de la planta, y a Pakamas Intachote, Suchada Sengsai y Busakorn Saimanee del Instituto de Investigación Chulabhorn por las evaluaciones de citotoxicidad.

Estos autores contribuyeron igualmente: Pornsuda Chawengrum y Natthaorn Luepongpatthana.

Programa de Biología Química, Instituto de Graduados Chulabhorn, Real Academia Chulabhorn, Bangkok, Tailandia

Pornsuda Chawengrum, Prasat Kittakoop y Somsak Ruchirawat

Programa de Ciencias Biológicas Aplicadas, Instituto de Graduados Chulabhorn, Real Academia Chulabhorn, Bangkok, Tailandia

Natthaorn Luepongpatthana y Jisnuson Svasti

Laboratorio de Productos Naturales, Instituto de Investigación Chulabhorn, Bangkok, Tailandia

Sanit Thongnest, Jutatip Boonsombat, Patcharin Kongwaen, Prasat Kittakoop y Somsak Ruchirawat

Centro de Excelencia en Salud Ambiental y Toxicología (EHT), Oficina del Secretario Permanente (OPS), Ministerio de Educación Superior, Ciencia, Investigación e Innovación (MHESI), Bangkok, Tailandia

Sanit Thongnest, Jutatip Boonsombat, Kriengsak Lirdprapamongkol, Prasat Kittakoop y Somsak Ruchirawat

Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Silpakorn, Nakhon Pathom, Tailandia

Jitnapa Sirirak

Laboratorio de Bioquímica, Instituto de Investigación Chulabhorn, Bangkok, Tailandia

Kriengsak Lirdprapamongkol, Siriporn Keeratichamroen, Phreeranat Montatip y Jisnuson Svasti

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Conceptualización, JB, KL; curación de datos, ST, JB, JS; KL, análisis formal SK, ST, JB, JS, KL, SK; adquisición de financiación, JB, KL, P.Kittakoop; investigación, PC, NL, JS, JB, PK, PM; metodología, ST, JB, JS, KL, SK; administración de proyectos, JB, KL; recursos, SR, J.Svasti; supervisión, SR, J.Svasti; validación, ST, JB, JS, KL, SK; redacción del borrador original, JB, KL; redacción, revisión y edición, ST, JB, JS, KL, SK, P.Kittakoop, J.Svasti, SR; Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Jutatip Boonsombat o Kriengsak Lirdprapamongkol.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Chawengrum, P., Luepongpatthana, N., Thongnest, S. et al. El derivado amida del ácido anticopálico induce la muerte celular no apoptótica en células de cáncer de mama triple negativo al inhibir la activación de FAK. Representante científico 13, 13456 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40669-6

Descargar cita

Recibido: 25 de marzo de 2023

Aceptado: 16 de agosto de 2023

Publicado: 18 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40669-6

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