Las amilasas bacterianas permiten la degradación del glucógeno por parte del microbioma vaginal

Nov 22, 2023

Nature Microbiology volumen 8, páginas 1641–1652 (2023)Cite este artículo

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La microbiota vaginal humana suele estar dominada por lactobacilos y la transición a una comunidad más diversa de microbios anaeróbicos se asocia con riesgos para la salud. Se cree que el glucógeno liberado por las células epiteliales lisadas es una importante fuente de nutrientes en la vagina. Sin embargo, el mecanismo por el cual las bacterias vaginales metabolizan el glucógeno no está claro, y la evidencia implica tanto a enzimas bacterianas como humanas. Aquí caracterizamos bioquímicamente seis enzimas que degradan el glucógeno (GDE), todas ellas pullanasas (homólogos de PulA), de bacterias vaginales que favorecen el crecimiento de Lactobacillus crispatus deficiente en amilasa en el glucógeno. Revelamos variaciones en su tolerancia al pH, preferencias de sustrato, productos de degradación y susceptibilidad a la inhibición. El análisis de los conjuntos de datos del microbioma vaginal muestra que estas enzimas se expresan en todos los tipos de estados comunitarios. Finalmente, confirmamos la presencia y actividad de GDE bacterianas y humanas en el líquido cervicovaginal. Este trabajo establece que los GDE bacterianos pueden participar en la descomposición del glucógeno, proporcionando información sobre el metabolismo que puede dar forma a la microbiota vaginal.

La disbiosis dentro de la microbiota vaginal humana se asocia con resultados adversos para la salud1. La composición de la comunidad bacteriana se puede clasificar taxonómicamente en uno de cinco tipos de estados comunitarios (CST)2. CST I–III y V están dominados por una sola especie de Lactobacillus: L. crispatus, L. gasseri, L. iners y L. jensenii, respectivamente. Por el contrario, CST IV consta de un grupo diverso de microbios anaeróbicos y anaeróbicos facultativos, incluidas especies de Gardnerella, Prevotella, Mobiluncus y niveles bajos de Lactobacillus. Las CST dominadas por Lactobacillus se asocian con un pH vaginal inferior a 4,5, puntuaciones de Nugent bajas y una inflamación reducida3, mientras que la CST IV se asocia con un pH más alto y varias secuelas de salud, incluida la adquisición del VIH4, la vaginosis bacteriana5 y el parto prematuro6. Sin embargo, es importante señalar que la CST IV está sobrerrepresentada en mujeres hispanas y negras sanas y no es necesariamente indicativa de disbiosis7. En general, ha quedado claro que la composición de la microbiota vaginal por sí sola es insuficiente para predecir los resultados de salud y que obtener una comprensión mecanicista de esta comunidad requiere descifrar las funciones bacterianas vaginales1.

Una función que se sabe que influye en la composición y estabilidad de las comunidades bacterianas asociadas al huésped es la liberación de carbohidratos de fuentes dietéticas o derivadas del huésped mediante las glucósidos hidrolasas. Si bien esto está bien establecido dentro de la microbiota intestinal humana8,9,10,11, el metabolismo de los carbohidratos en el ambiente vaginal no se conoce bien. Se cree ampliamente que el glucógeno liberado por las células epiteliales exfoliadas y lisadas apoya la colonización de lactobacilos vaginales12,13 ya que los niveles de glucógeno en muestras vaginales están asociados con la dominancia de Lactobacillus y el bajo pH vaginal14. Sin embargo, hasta hace poco, los intentos de obtener aislados vaginales de Lactobacillus capaces de crecer en glucógeno fueron en gran medida infructuosos15,16, lo que plantea la cuestión de si las bacterias vaginales acceden a esta fuente de carbono y cómo.

El glucógeno consta de cadenas lineales de unidades de glucosa unidas a α-1,4-glucosídicos, con ramas periódicas de α-1,6-glucosídicos. El metabolismo del glucógeno requiere glucósidos hidrolasas extracelulares para liberar polímeros de glucosa más cortos (maltodextrinas). Varios lactobacilos vaginales utilizan maltodextrinas para crecer, lo que lleva a la hipótesis inicial de que una glucósido hidrolasa distinta de Lactobacillus en el ambiente vaginal libera estos oligosacáridos17. La detección de α-amilasa humana en muestras de lavado cervicovaginal (CVL) puede respaldar esta propuesta17,18. Pero aún no se ha establecido cómo se encuentra la amilasa humana, que se produce predominantemente en el páncreas y las glándulas salivales17, en el líquido genital.

Además de la amilasa humana, trabajos recientes identificaron otras enzimas que degradan el glucógeno en el fluido vaginal, incluidas las glucosidasas del parásito Trichomonas vaginalis y varias enzimas bacterianas no caracterizadas detectadas mediante proteómica19,20,21. En particular, se ha sugerido una supuesta pululanasa tipo 1 secretada (PulA, EEU28204.2) de L. crispatus como enzima degradante de glucógeno (GDE) candidata sobre la base de la variación de una cepa a otra en su péptido señal predicho (SP ), que se correlaciona con el crecimiento de glucógeno22,23.

Las pululanasas hidrolizan los enlaces α-1,6-glucosídicos del pululano y otros oligosacáridos ramificados, liberando maltodextrinas24. Los homólogos de PulA están codificados en varios genomas bacterianos vaginales25, lo que sugiere que esta enzima no se limita a L. crispatus y destaca el potencial de competencia bacteriana por el glucógeno. En particular, los estudios proteómicos han identificado supuestas pululanasas de L. iners y Gardnerella vaginalis en CVL, pero su actividad no fue validada bioquímicamente21. La especificidad prevista del enlace α-1,6-glucosídico de las pululanasas plantea interrogantes sobre el destino del esqueleto de glucógeno restante y cómo se hidrolizan las ramas más largas. La identificación de estas enzimas bacterianas también plantea dudas sobre el papel relativo de la amilasa humana en el ecosistema vaginal. Claramente, se necesita una caracterización bioquímica de las enzimas bacterianas vaginales para mejorar nuestra comprensión del metabolismo del glucógeno en este entorno.

Aquí informamos la caracterización bioquímica de seis homólogos de PulA de bacterias vaginales que representan CST dominadas por Lactobacillus (I y III) y los diversos CST IV. Nuestro estudio revela que, a pesar de una anotación común, estas enzimas exhiben variabilidad en sus perfiles de pH, perfiles de productos de degradación de glucógeno, preferencias de sustrato y susceptibilidad a inhibidores. Al analizar conjuntos de datos multiómicos, revelamos que los genes que codifican estos GDE están presentes y transcritos en todos los CST. Utilizando perfiles de proteínas basados ​​en actividad (ABPP)26 y un ensayo enzimático selectivo, demostramos que tanto los GDE humanos como bacterianos están presentes y activos en el fluido vaginal cervical (CVF). En general, este trabajo proporciona información molecular sobre el metabolismo bacteriano de una abundante fuente de carbono en la microbiota vaginal.

Para identificar GDE bacterianas vaginales candidatas, realizamos una búsqueda BLASTp de 151 genomas aislados vaginales en la base de datos IMG utilizando L. crispatus PulA (EEU28204.2) como secuencia de consulta22, con un límite de identidad de aminoácidos del 35%. Los resultados se redujeron aún más a aquellos que contenían tanto un dominio de glucósido hidrolasa como un péptido señal, ya que la degradación del glucógeno se produce extracelularmente27. Se identificaron un total de 62 homólogos en cepas de 11 especies bacterianas (Archivo complementario 1), incluida L. crispatus (7/9 cepas en la base de datos, identidad de aminoácidos promedio del 99% según nuestra consulta), L. iners (12/13 , 45%), Mobiluncus mulieris (2/4, 43%), Prevotella bivia (2/2, 40%) y G. vaginalis (15/18, 37%). El análisis de la vecindad genética reveló otra glucósido hidrolasa que contiene un péptido señal (GH13) codificada junto a P. bivia pulA (25% de identidad con PulA), por lo que esta secuencia también se incluyó. Los esfuerzos de caracterización posteriores se centraron en este conjunto de proteínas. También detectamos homólogos potenciales con menor identidad (Archivo complementario 1), incluido uno de Streptococcus agalacticae y una proteína significativamente más pequeña en G. vaginalis homóloga a una enzima α-glucosidasa recientemente reportada que es activa sobre la maltosa y otros oligosacáridos pero no degrada el glucógeno28 .

El análisis del dominio PFAM reveló que los seis GDE candidatos contienen un dominio de proteína A de capa S (SlpA), un dominio de unión a la pared celular (CWB) o hélices transmembrana (TM), lo que sugiere una localización en la superficie celular29,30,31. Además, cada proteína contiene al menos un dominio catalítico de α-amilasa (PF00128), un miembro de la familia de enzimas glucósido hidrolasa 13 que se sabe que escinde varios enlaces glucosídicos32. Curiosamente, la enzima G. vaginalis tiene dos dominios de amilasa. Varias enzimas poseen supuestos dominios de unión a carbohidratos comunes a las enzimas bacterianas de esta clase, incluido el dominio pululanasa (PUD; PF03714)33. Los módulos de unión a carbohidratos (CBM) adicionales de la base de datos CAZy que se encuentran en estas enzimas incluyen CBM25 y CBM48, que participan en la unión de diferentes α-glucanos lineales y cíclicos relacionados con el almidón y el glucógeno32,34 y en la unión multivalente a amilopectina y pululano solubles35 ( Figura 1a).

a, Dominios previstos en supuestas GDE extracelulares bacterianas vaginales. α-amilasa, dominio catalítico de α-amilasa (GH13); Malta C, dominio ciclomaltodextrinasa. b, Crecimiento de L. crispatus C0176A1 (pulA−, JAEDCG000000000) y MV-1A-US (pulA+) en diferentes fuentes de carbono. c, L. crispatus C0176A1 (pulA-) cultivada en glucógeno de ostra suplementado con L. crispatus PulA purificada 200 nM. d, valores de DO600 de 24 h de L. crispatus C0176A1 (pulA-) cultivado en glucosa, maltosa o glucógeno suplementado con proteína purificada de 200 a 400 nM (L. crispatus PulA frente a M. mulieris PulA, P = 0,0084; L. crispatus PulA frente a P. bivia PulA, P < 0,0001; L. crispatus PulA frente a P. bivia GH13, P < 0,0001). Todas las curvas de crecimiento son representativas de tres réplicas experimentales (n = 3). Las barras de error representan una desviación estándar por encima y por debajo de la media de todos los datos recopilados. Se realizó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) de comparaciones múltiples (Tukey) para determinar la significación estadística. **P ≤ 0,01, ****P ≤ 0,0001.

Datos fuente

Para examinar su capacidad para degradar el glucógeno, expresamos y purificamos de forma heteróloga cada enzima (Datos ampliados, Fig. 1 y Fig. 1 complementaria), luego probamos si rescató el crecimiento de una cepa de L. crispatus deficiente en pulA en glucógeno (Fig. 1b, cy Datos ampliados Fig. 2). La adición de PulA de L. crispatus purificada al medio restauró el crecimiento, proporcionando evidencia directa de que PulA es suficiente para el metabolismo del glucógeno de L. crispatus22 (Fig. 1c y Datos ampliados Fig. 2). Las otras enzimas también apoyaron el crecimiento (Fig. 1d y Datos ampliados Fig. 2), aunque las densidades más bajas de los cultivos cultivados con las enzimas M. mulieris PulA y P. bivia sugieren que no son tan eficientes en la degradación del glucógeno, o que su Los productos de oligosacáridos específicos no son tan accesibles para L. crispatus.

A continuación, medimos la cinética de descomposición de una variedad de polímeros de glucosa para determinar la preferencia y especificidad del sustrato de cada enzima para diferentes enlaces glicosídicos (Tabla 1 y Datos ampliados, Figura 3). Además del glucógeno, analizamos la amilosa, que consta únicamente de enlaces α-1,4-glucosídicos, y el pululano, que consta de unidades de maltotriosa conectadas por enlaces α-1,6-glucosídicos. Todas las enzimas fueron activas sobre el glucógeno (Tabla 1 y Datos ampliados, Fig. 3). Curiosamente, los mutantes de la enzima G. vaginalis con cualquiera de los dos dominios de amilasa inactivados retuvieron solo el 5% de la actividad de tipo salvaje, lo que sugiere que los dos dominios pueden actuar sinérgicamente (Datos ampliados, figura 4). Todas las enzimas fueron activas sobre el pululano, lo que sugiere que escinden enlaces α-1,6-glucosídicos, pero diferían en su actividad hacia los enlaces α-1,4-glucosídicos en la amilosa, con L. crispatus, L. iners, G. vaginalis y Las enzimas P. bivia GH13 mostraron actividad, mientras que las enzimas M. mulieris y P. bivia PulA estaban inactivas (Tabla 1 y Datos ampliados, Fig. 3).

Los parámetros cinéticos medidos de estos GDE coincidieron en términos generales con los de otras enzimas bacterianas que procesan estos sustratos (glucógeno36,37,38, amilosa39,40, pululano39,41). La comparación de las constantes de especificidad (kcat/Km) para cada sustrato reveló que el glucógeno es el sustrato preferido para las enzimas G. vaginalis y L. iners. L. crispatus PulA tenía constantes de especificidad similares tanto para el pululano como para el glucógeno, con actividad hacia la amilosa. P. bivia PulA y M. mulieris PulA tuvieron constantes de especificidad más altas para pululano en comparación con glucógeno y amilosa, mientras que la enzima P. bivia GH13 prefirió la amilosa (Tabla 1 y Datos ampliados, Fig. 3). En general, estas enzimas variaron en su preferencia de sustrato a pesar de compartir homología con L. crispatus PulA.

Las CST con predominio de Lactobacillus se asocian típicamente con un pH vaginal bajo (<4,5)42 debido a la producción de ácido láctico14. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que los GDE de los lactobacilos pueden haber evolucionado para mantener la actividad a un pH más bajo que los de otras bacterias vaginales. Medimos la actividad de GDE en el glucógeno en un rango de pH de 2,5 a 8,0 (Fig. 2). Cinco de los GDE exhibieron actividad máxima entre pH 5,5 y 6,0, lo que es consistente con otras pululanasas y amilopululanasas bacterianas caracterizadas43. P. bivia PulA exhibió actividad máxima a un pH ligeramente más bajo, entre 4,5 y 5 (Fig. 2). La mayoría de las enzimas de los anaerobios vaginales (G. vaginalis PulA, M. mulieris PulA y P. bivia GH13: casi no mostraron actividad a pH 4,0. Sin embargo, lo más importante es que L. crispatus, L. iners y P. bivia PulA mostraron el 34%, 51% y 97% de su actividad máxima a pH 4,0, lo que sugiere que están mejor adaptados a un entorno de pH bajo. Esta actividad puede explicar cómo los lactobacilos vaginales pueden utilizar el glucógeno derivado del huésped en condiciones de pH bajo, contribuyendo potencialmente a su dominio.

Perfiles de pH de seis enzimas extracelulares que degradan el glucógeno. Los sistemas tampón consistían en glicina (pH = 2,5–3,3), acetato de sodio (pH = 4,0–5,5), MES (pH = 6,0–6,5) y HEPES (pH = 7,0–8,0). Los datos son representativos de tres experimentos independientes durante 2 días (n = 3).

Datos fuente

A continuación, buscamos caracterizar y cuantificar los productos oligosacáridos específicos de cada enzima (Fig. 3). Tanto la amilasa humana como la GH13 de P. bivia produjeron predominantemente disacáridos de glucosa (G2) y una pequeña cantidad de glucosa (G1) a partir de glucógeno y amilosa. Por el contrario, las enzimas denominadas pululanasas de tipo I produjeron oligosacáridos más largos además de G2, incluidos trisacáridos de glucosa (G3) y, en algunos casos, tetrasacáridos de glucosa (G4). Estos resultados se parecen a los observados para amilopululanosis bacterianas previamente caracterizadas44,45. G4 no se detectó en ensayos con G. vaginalis PulA y solo se detectó en un nivel bajo en ensayos con las enzimas M. mulieris y P. bivia. Sin embargo, las enzimas PulA derivadas de Lactobacillus produjeron una cantidad relativa mayor de G4 cuando actúan sobre la amilosa o el glucógeno. Durante la incubación con pululano, todas las enzimas bacterianas produjeron predominantemente G3, mientras que la amilasa salival humana estaba inactiva. La producción exclusiva de G3 es común entre las enzimas que degradan el pululano41,43,44,46. En particular, la actividad pululanasa parece exclusiva de las GDE bacterianas vaginales y no la exhibe la enzima humana (Tabla 1 y Fig. 3).

Productos de degradación del polímero generados después de una incubación durante la noche con enzima purificada. El análisis LC-MS es representativo de tres experimentos independientes realizados durante 3 días (n = 3). Las barras de error representan una desviación estándar por encima y por debajo de la media. G1, glucosa; G2, maltosa e isómeros; G3, maltotriosa e isómeros; G4, maltotetraosa e isómeros; G5, maltopentaosa e isómeros.

Datos fuente

Los productos G3 específicos de la degradación del pululano se identificaron mediante cromatografía de capa fina (TLC). Todas las enzimas, excepto P. bivia GH13, produjeron maltotriosa, lo que confirma su capacidad para escindir enlaces α-1,6-glucosídicos. P. bivia GH13 produjo panosa, lo que sugiere que esta enzima escinde solo los enlaces α-1,4-glucosídicos en el pululano (Datos ampliados, figura 5). Estos datos, junto con los análisis cinéticos (Tabla 1), demuestran que tanto las enzimas Lactobacillus PulA como la enzima G. vaginalis PulA pueden escindir los enlaces glicosídicos α-1,4 y α-1,6 que se encuentran en el glucógeno y respaldan su reasignación. como pululanasas de tipo II o amilopululanasas (EC. 3.2.1.1/41, revisada en la ref. 45). P. bivia GH13 solo escinde enlaces α-1,4-glicosídicos (incluso dentro del pululano), identificando esta enzima como una pululano hidrolasa tipo I o neopululanasa (EC 3.2.1.135, revisado en la ref. 47). Por el contrario, la falta de actividad de las enzimas PulA de M. mulieris y P. bivia hacia la amilosa las identifica como pululanasas de tipo I (EC 3.2.1.41) y puede explicar su capacidad reducida para complementar el crecimiento de L. crispatus en glucógeno (Fig. 1d). y 3, Tabla 1 y Datos Ampliados Fig. 5).

Dado su papel en permitir el crecimiento del glucógeno y las distinciones bioquímicas entre diferentes GDE, planteamos la hipótesis de que estas enzimas pueden ser objetivos para una posible intervención terapéutica destinada a establecer una comunidad dominante de Lactobacillus. De los cuatro inhibidores de amilasa utilizados clínicamente, solo la acarbosa y la acarviosina mostraron actividad hacia los GDE (Datos ampliados, figura 6a). La acarbosa inhibió las enzimas G. vaginalis PulA, P. bivia PulA y P. bivia GH13, con valores de concentración inhibidora media máxima (IC50) de 120 ± 30 μΜ, 420 ± 90 μΜ y 0,84 ± 0,05 μΜ, respectivamente, mientras que L. Las enzimas crispatus, L. iners y M. mulieris no se vieron afectadas en gran medida (Datos ampliados, Fig. 6b).

Dado que la acarbosa inhibió selectivamente las GDE de los microbios asociados a CST IV, caracterizamos su efecto sobre el crecimiento bacteriano como un primer paso para probar su utilidad para la modulación comunitaria. Mientras que la acarbosa inhibió el crecimiento de G. vaginalis en glucógeno (IC50 = 0,2 μM), también inhibió el crecimiento de L. crispatus en maltosa (IC50 = 22 μM) y glucógeno (IC50 = 0,1 μM), aunque L. crispatus PulA no se vio afectada in vitro. . Curiosamente, el crecimiento de L. crispatus no se vio afectado cuando la glucosa fue la principal fuente de carbono (Datos ampliados, Fig. 6c). Estos datos sugieren que la acarbosa inhibe enzimas adicionales de L. crispatus implicadas en el metabolismo de la maltodextrina. A pesar de inhibir potentemente P. bivia GH13 in vitro, la acarbosa no tuvo ningún impacto en el crecimiento de P. bivia en ningún sustrato (Datos ampliados, figura 6c). Esto sugiere que P. bivia PulA, que era menos susceptible a la inhibición in vitro, es probablemente el GDE predominante en este organismo y que el catabolismo intracelular de la maltodextrina en P. bivia no se ve afectado por la acarbosa. En general, aunque la acarbosa no es un candidato adecuado para la modulación comunitaria debido a su amplio espectro objetivo, estos resultados resaltan las diferencias entre los GDE que potencialmente pueden ser objetivo de la inhibición selectiva.

Habiendo identificado GDE bacterianas vaginales auténticas, a continuación buscamos comprender la presencia y expresión de genes que codifican estas enzimas en el entorno vaginal. Si bien otras búsquedas han detectado supuestas amilasas bacterianas en muestras clínicas utilizando proteómica21, metagenómica y metatranscriptómica23,48, las actividades de estas enzimas no fueron verificadas bioquímicamente. Empleamos shortBRED (Conjunto de datos de extractos cortos y mejores representativos) para identificar GDE caracterizados bioquímicamente en un conjunto de datos de 178 metagenomas y metatranscriptomas vaginales emparejados de 40 mujeres no embarazadas en edad reproductiva que recolectaron hisopos vaginales por sí mismas durante 10 semanas48,49. ShortBRED es una herramienta computacional que identifica y cuantifica secuencias de aminoácidos únicas que son distintas de una proteína de consulta (límite de identidad del 85%). A diferencia de estudios anteriores, se predice que todas las enzimas investigadas son extracelulares y degradan el glucógeno in vitro, lo que aumenta la confianza en que cualquier resultado también posee esta actividad.

Las lecturas combinadas de los seis GDE fueron más abundantes en los metagenomas de CST I en comparación con los metagenomas de CST II y CST IV (Fig. 4a). Esta mayor abundancia en las muestras de CST I se debe a L. crispatus pulA (Fig. 4b), que se detectó en el 84,6% de los metagenomas y el 89,7% de los metatrascriptomas de los participantes de CST I. M. mulieris pulA no se detectó en estos individuos y los otros cuatro GDE se detectaron en menos del 11% de los metagenomas y metatranscriptomas (Datos ampliados, figura 7). En las muestras de CST III, que estaban dominadas por L. iners, se detectó L. iners pulA en el 41,9% y el 32,3% de los metagenomas y metatranscriptomas, respectivamente. Curiosamente, se detectaron genes que codifican otras GDE (L. crispatus PulA, G. vaginalis PulA, ambas P. bivia GDE) en> 20% de los metagenomas de CST III. Sin embargo, la detección de estos genes en los metatranscriptomas fue muy variable (6,45% –38,7%).

a, Análisis metagenómico de 178 muestras de participantes utilizando el análisis ShortBRED de GDE caracterizados bioquímicamente estratificados por CST. Sólo se representaron muestras que codifican una GDE bacteriana. El % de codificación representa el porcentaje de muestras que contienen >0 genes por genoma bacteriano. Se realizó un ANOVA unidireccional de comparaciones múltiples (Dunnett) para determinar diferencias estadísticamente significativas en comparación con la abundancia de CST I (CST IV, ****P < 0,0001; CST V, *P = 0,0196; NSP > 0,05). El cuadro representa 1,5 veces el rango intercuartil y los bigotes representan el mínimo al máximo del conjunto de datos. La línea central denota la mediana. b, Mapa de calor de presencia y abundancia metagenómica detectado utilizando ShortBRED dentro de cada muestra. NP, no presente. c, el análisis ABPP identifica GDE bacterianas y proteínas humanas (α-amilasa y GAA) en sobrenadantes de CVF. ND, no detectado; GAA, α-glucosidasa lisosomal. d, Human CVF contiene actividad pululanasa claramente bacteriana a pH 5,5. Los datos son representativos de tres réplicas experimentales durante 2 días y las barras de error están una desviación estándar por encima y por debajo de la media. Se realizó un ANOVA unidireccional de comparaciones múltiples (Dunnett) para determinar diferencias estadísticamente significativas en comparación con la muestra sin FVC (azul) (S003, ****P < 0,0001; S011, ****P < 0,0001).

Datos fuente

Todos los GDE se detectaron en los metagenomas de CST IV con frecuencias del 16,9% al 36,1%. Mientras que L. crispatus pulA se detectó en el 39,8% de los metatranscriptomas CST IV, las transcripciones de otros GDE se detectaron en solo el 3,6%-10,8% de los conjuntos de datos (Datos ampliados, figura 7). En general, este análisis demuestra que las GDE bacterianas caracterizadas están presentes en los metagenomas vaginales y se expresan en varias CST bacterianas vaginales, y las comunidades CST III y CST IV en particular albergan GDE de múltiples especies.

A continuación, intentamos detectar la actividad de GDE bacterianas y amilasa humana en muestras clínicas. Inicialmente analizamos 20 sobrenadantes de muestras de CVL que abarcan un rango de puntuaciones de Nugent (0 a 8), comparando la actividad de amilasa total con la concentración de amilasa humana determinada mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) (Figura 2 complementaria y Figura 8 de datos ampliados). ). Se realizaron ensayos de actividad con un sustrato de almidón fluorescente en una variedad de pH, que abarcaban desde el ambiente vaginal saludable (4,4) hasta el óptimo para la amilasa humana (6,8). En todos los valores de pH, hubo una correlación estadísticamente significativa entre estas mediciones (Datos ampliados, figura 8), lo que sugiere que la mayor parte de la actividad de la amilasa es humana. Sin embargo, es interesante observar que a medida que el pH disminuyó, el coeficiente de correlación se redujo, lo que quizás sugiere una mayor contribución de otras enzimas a un pH más bajo (Datos ampliados, figura 8). Al comparar estos resultados con las puntuaciones de Nugent (Nugent bajo 0–3, Nugent alto 7–10), no encontramos diferencias en la actividad de amilasa o los niveles de amilasa humana (Figura complementaria 3). Para confirmar la especificidad del ELISA para la enzima humana, analizamos nuestras enzimas bacterianas purificadas usando el mismo kit y no encontramos reactividad cruzada en concentraciones de enzima tan altas como 1 μM (Figura complementaria 2). En conjunto, estos resultados indican que no debe pasarse por alto la contribución de la amilasa humana a la degradación del glucógeno, a pesar de la existencia de enzimas bacterianas con actividades relacionadas.

A continuación, intentamos determinar si los GDE bacterianos estaban activos en muestras de FVC aplicando perfiles de proteínas basados ​​en la actividad (ABPP)50 utilizando sondas dirigidas a las enzimas amilasa (Amy-ABP) y glucosidasa (Glc-ABP). Después de confirmar que los GDE bacterianos purificados reaccionaron con al menos una sonda (Figuras complementarias 4 y 5), los sobrenadantes de CVF se marcaron con sondas marcadas con biotina, seguido de espectrometría de masas en tándem con cromatografía líquida, digestión tríptica y desplegable (LC-MS). /MS) identificación de los péptidos. La sonda Amy-ABP identificó L. crispatus PulA, L. iners PulA y G. vaginalis AmyA en estas muestras (Fig. 4c y Datos ampliados Fig. 9). L. crispatus PulA y L. iners PulA fueron mutuamente excluyentes, lo que coincide con estudios previos que encontraron que su coexistencia era poco común7. En una muestra (S004), observamos la coexistencia de dos enzimas bacterianas: L. iners PulA y G. vaginalis AmyA. Aunque no caracterizamos G. vaginalis AmyA en este estudio (debido a su baja similitud de aminoácidos con L. crispatus PulA), recientemente se demostró que degrada el glucógeno51. También detectamos α-amilasa humana (AMY1) en la mayoría de las muestras (Fig. 4c y Datos ampliados Fig. 9). A diferencia de las proteínas enriquecidas con Amy-ABP, todas las proteínas enriquecidas con Glc-ABP eran de origen humano. La proteína con mayor intensidad fue la α-glucosidasa lisosomal, que está canónicamente localizada en el lisosoma pero que se ha detectado previamente en CVF (Fig. 4c, Datos ampliados, Fig. 9 y archivo complementario 1)52,53,54. En general, estos datos demuestran que los GDE bacterianos están presentes y activos en el entorno vaginal, incluidos L. crispatus PulA, L. iners PulA y G. vaginalis AmyA.

Para validar aún más la actividad de los GDE bacterianos en estas muestras, utilizamos un ensayo basado en LC-MS para detectar la degradación del pululano, aprovechando la observación de que todos los GDE caracterizados metabolizan el pululano, mientras que la amilasa humana no lo hace (Fig. 3). Cada muestra de CVF mostró actividad en este ensayo (Datos ampliados, figura 10). En particular, las dos muestras más activas, S003 y S011, tuvieron la mayor intensidad de L. crispatus PulA en el experimento ABPP (Fig. 4c) y generaron niveles significativamente mayores de G3 en comparación con un control sin CVF (Fig. 4d). Estos resultados demuestran además que los GDE bacterianos vaginales están activos en muestras clínicas y validan un ensayo simple y accesible para GDE bacterianos que no depende de flujos de trabajo proteómicos.

En este estudio, caracterizamos bioquímicamente seis GDE de bacterias vaginales. Nuestros resultados demuestran que, además de depender de la amilasa humana, algunas bacterias vaginales poseen enzimas alternativas para acceder al glucógeno. Estos hallazgos están validados aún más por un informe separado sobre la actividad degradante de glucógeno de L. crispatus PulA (GlgU, 99% de identidad)55. Fundamentalmente, a pesar de compartir una anotación común, encontramos que las preferencias de sustrato y los productos de degradación de los GDE bacterianos son bastante distintos. Esto es consistente con los módulos únicos de unión a carbohidratos que se encuentran en cada proteína y puede sugerir una adaptación para procesar polímeros de glucosa estructuralmente distintos en el ambiente vaginal. Además, dado que los oligosacáridos producidos a partir de la descomposición del glucógeno se liberan extracelularmente y pueden actuar como "bienes públicos"56, las diferencias en las distribuciones de productos de estas enzimas pueden sugerir que la disponibilidad diferencial de oligosacáridos derivados del glucógeno entre las CST respalda el crecimiento de distintas bacterias que degradan el glucógeno mediante alimentación cruzada11. Se necesita una mejor comprensión de la estructura del glucógeno dentro del ambiente vaginal y si difiere entre los CST para evaluar más a fondo esta posibilidad.

Nuestro trabajo también sugiere un mecanismo potencial que respalda el crecimiento y la dominancia de L. crispatus. Específicamente, descubrimos que L. crispatus PulA es activa en valores de pH bajos (~3,5–4) asociados con la salud vaginal. Por lo tanto, esta actividad enzimática puede permitir que L. crispatus acceda al glucógeno en condiciones en las que la amilasa humana es mínimamente activa y se inhibe el crecimiento de bacterias competidoras. Fundamentalmente, los perfiles de pH, las preferencias de sustrato y los productos de descomposición de las amilasas no se pueden predecir a partir del análisis de secuencia primaria, lo que destaca aún más la necesidad de una caracterización bioquímica para respaldar los interrogatorios bioinformáticos del metabolismo bacteriano dentro del microbioma humano.

La alta prevalencia de L. crispatus PulA en los metagenomas de CST I (85%) sugiere además un papel importante de esta enzima. En particular, en las muestras de CST III dominadas por L. iners, la enzima PulA homóloga es mucho menos prevalente (42%), lo que quizás sugiere que L. iners depende menos del glucógeno o depende más de otras enzimas. Además, nunca se ha informado sobre la degradación del glucógeno para L. gasseri o L. jensennii y no encontramos homólogos de PulA codificados en sus genomas, lo que deja preguntas abiertas sobre el metabolismo del glucógeno en CST II y V.

Un desafío importante en la caracterización del metabolismo del glucógeno en muestras clínicas ha surgido de las dificultades para distinguir la actividad de la amilasa humana y bacteriana21. Nuestro uso de ABPP identifica categóricamente enzimas activas en estas muestras complejas. Además, nuestro sencillo ensayo basado en LC-MS para la actividad pululanasa identifica rápidamente la actividad bacteriana de GDE. Nuestros resultados y los de otros esfuerzos recientes17,21 muestran que la actividad bacteriana de GDE es muy variable, lo que destaca la necesidad de analizar un mayor número de muestras clínicas mejor caracterizadas. Anticipamos que el ensayo de actividad pululanasa encontrará una amplia utilidad en el análisis de dichas muestras y permitirá estudios adicionales de las funciones biológicas de las GDE bacterianas57.

En general, los conocimientos adquiridos en esta investigación resaltan la necesidad de complementar el análisis bioinformático con una caracterización bioquímica detallada de las enzimas bacterianas vaginales. Esta mejor comprensión de las actividades de los GDE bacterianos vaginales permitirá la exploración futura del metabolismo del glucógeno bacteriano en el microbioma vaginal y su contribución a la composición, estabilidad y disbiosis de la comunidad.

Este trabajo cumplió con todas las normas éticas pertinentes y obtuvimos el consentimiento informado de todos los donantes. Los protocolos del estudio fueron aprobados por el Hospital General de Massachusetts (IRB: 2014P001066) y las filiales de la Universidad de Seattle (IRB: FY2022‐002).

Se identificaron homólogos de PulA en L. crispatus22 (EEU28204.2) mediante búsquedas BLASTp de genomas de aislados vaginales en la base de datos IMG58 utilizando un valor de corte E de 1 × 10-5. La base de datos IMG contiene 151 genomas aislados vaginales del Proyecto Microbioma Humano con un subsitio corporal de muestra de "vaginal" (Archivo complementario 1). Se eliminaron los resultados sin péptido señal predicho (SignalP v.5.0 (ref. 59)). Se seleccionaron seis candidatos con >35% de identidad de aminoácidos de microbios asociados con la salud o la enfermedad. El ADN genómico se extrajo de las cepas codificantes con un kit microbiano DNeasy UltraClean (Qiagen). Los genes se amplificaron mediante PCR eliminando el péptido señal (Figura 1 complementaria) y se clonaron en el vector de expresión de E. coli pET28a (Novagen) mediante un ensamblaje de Gibson para generar un gen marcado con His6 N-terminal. Luego, los plásmidos se transformaron en el huésped de expresión BL21 (DE3) (enzimas de P. bivia) o ArcticExpress (DE3) (todas las demás enzimas) para su expresión y purificación. Se proporcionan listas completas de plásmidos y cebadores en la Tabla complementaria 2 y el Archivo complementario 1, respectivamente.

Los cultivos que contenían plásmidos de expresión se cultivaron en medio LB que contenía 50 μg ml-1 de kanamicina hasta una densidad óptica a 600 nm (DO600) de 0,6 a 0,8, luego se enfriaron a 15 °C y se indujeron con isopropil β-D-1 tiogalactopiranósido 250 μM ( IPTG). Después de 16 h a 15 °C, se recogieron las células y los sedimentos se almacenaron a -20 °C hasta su uso. Los sedimentos se resuspendieron en tampón A al 98 % (HEPES 50 mM, KCl 300 mM, glicerol al 10 %, pH 7,8) y tampón B al 2 % (HEPES 50 mM, KCl 300 mM, glicerol al 10 %, imidazol 500 mM, pH 7,8) suplementados. con cóctel inhibidor de proteasa libre de EDTA (Sigma). Las células se lisaron mediante homogeneización (3 x 15 000 psi, Emulsiflex-C3, Avestin) y los lisados ​​se clarificaron (16 000 x g durante 45 min a 4 ° C) antes de cargarlos en una columna HisTrap de 5 ml (GE Healthcare). A esto le siguió un volumen de columna (cv) de tampón B al 2 % y 2 cv de tampón B al 10 %. La proteína se eluyó usando un gradiente lineal del 10 al 100 % de tampón B sobre 20 cv. Las fracciones que contienen proteínas y la pureza se determinaron mediante SDS–PÁGINA. Las fracciones que contenían amilasa se combinaron, se concentraron hasta un volumen de aproximadamente 1 ml en un concentrador de rotación (Millipore) y se purificaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño (GE Healthcare, Superdex 200) en tampón A al 100 %.

Las fracciones se analizaron nuevamente mediante SDS-PAGE y las fracciones que contenían proteínas se combinaron, se concentraron (Millipore, Amicon 30 kDa), se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. La concentración de proteínas se determinó mediante un ensayo de Bradford.

Se preparó caldo MRS que contenía glucosa (BD Difco) según el protocolo del fabricante. Para ensayos de crecimiento en diferentes fuentes de carbono, se preparó caldo MRS sin glucosa (Food Check Systems, pH 6,5–6,6) según la receta del fabricante y se complementó con 2% de d-glucosa (Sigma), 2% de maltosa monohidrato (VWR) o 5% de glucógeno de ostra (Sigma). Cada tipo de medio se esterilizó por filtración (0,2 µm) y se dejó dentro de una cámara anaeróbica con una atmósfera de 2,5% H2, 5% CO2 y 92,5% N2 (Coy Labs) durante la noche para equilibrarlo. Se inocularon cultivos iniciadores de L. crispatus C0176A1 y L. crispatus MV-1A-US en medio MRS (BD Difco) en tubos Hungate y se incubaron durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, la proteína purificada se descongeló y se añadió a un medio MRS con glucógeno al 5% hasta una concentración que oscilaba entre 200 y 400 nM. El medio se esterilizó nuevamente por filtración antes de su uso. Como control negativo se incluyó proteína hervida a 100 °C durante 15 min. De cada tipo de medio, se repartieron alícuotas de 50 µl en una microplaca transparente tratada con cultivo de tejidos de 384 pocillos (Corning). Se utilizó cultivo nocturno (1 µl) para inocular cada pocillo. La placa se selló y el crecimiento se controló en un lector de placas (Biotek) dentro de una cámara anaeróbica (Coy Labs) a 37 °C durante 24 h midiendo la DO600 cada 15 min.

El análisis cinético de los GDE se realizó mediante un ensayo de azúcar reductor41, modificado para un formato de 96 pocillos. Se configuraron reacciones (300 μl) que contenían sustrato (0,0048–10 mg ml-1 de glucógeno; 0,0012–1,25 mg ml-1 de Pullulan (Megazyme); o 0,0048–1,25 mg ml-1 de amilosa en una concentración final de 2% de dimetilsulfóxido. ), enzima 0,8–700 nM y tampón de reacción (acetato de sodio 20 mM, pH 5,5, CaCl2 0,5 mM). Las mezclas de reacción se incubaron a 37 °C durante 15 min y se retiraron alícuotas de 50 µl (2, 5, 7,5, 10, 15 min) en 125 µl de la solución de parada de BCA (carbonato de sodio 0,4 M, pH 10,7, CuSO4 2,5 mM, 4,4'-dicarboxi-1,2'-biquinolina 2,5 mM, l-serina 6 mM). Después de 30 minutos de incubación a 80 °C, las absorbancias se leyeron a 540 nm y se compararon con una curva estándar de maltosa (0,000610–0,625 mg ml-1) para cuantificar la actividad. Las velocidades iniciales se calcularon mediante regresión lineal, seleccionando los puntos de datos que produjeron la tasa inicial más alta, utilizando al menos tres puntos de datos. Los parámetros KM y kcat se determinaron ajustando la ecuación de Michaelis-Menten mediante regresión no lineal (Graphpad Prism 8).

Se colocó un volumen de 1 µl de las mezclas de reacción de GDE en una placa de TLC y se hizo funcionar durante aproximadamente 5 h en butanol:ácido acético:agua 3:2:1. La placa se retiró, se secó durante 10 minutos con una pistola térmica y se roció con una solución de ácido sulfúrico:etanol 1:19. La placa se reveló calentando durante 15 minutos con una pistola de calor hasta que aparecieron manchas. La identidad de los productos se confirmó mediante la ejecución conjunta de estándares puros.

Las reacciones se realizaron utilizando el ensayo de azúcar reductor (ver arriba) con 1,25 mg ml-1 de glucógeno, enzima de 0,9 a 850 nM y tampón de ensayo con un pH de 2,5 a 8,0 (pH de 2,5 a 3,3: glicina 20 mM, CaCl2 0,5 mM; pH 4,0–5,5: acetato de sodio 20 mM, CaCl2 0,5 mM; pH 6,0–6,5: MES 20 mM, CaCl2 0,5 mM; pH 7,0–8,0: HEPES 20 mM, CaCl2 0,5 mM). Se construyeron mutantes del sitio activo PulA de G. vaginalis utilizando un conjunto Gibson multifragmentado amplificado a partir del vector de expresión de tipo salvaje pETpullGV utilizando los cebadores enumerados en el archivo complementario 1. pETpullGV-AS1 (∆AS1) y pETpullGV-AS2 (∆AS2) contenían un D233A. y mutación D1317A, respectivamente, diseñadas para inactivar el aspartato catalítico de los dominios de amilasa de estas proteínas. pETpullGV-DM (∆DBL) contenía ambas mutaciones. Las actividades específicas de los mutantes del sitio activo PulA de G. vaginalis se determinaron a pH 5,5.

Se configuraron reacciones que contenían 10 mg ml-1 de sustrato y enzima 500 nM, todas disueltas en tampón de reacción y se incubaron a 37 °C durante la noche. Las muestras se inactivaron mediante dilución 10 veces en acetonitrilo al 90 %. Las placas se centrifugaron (3220 × g durante 10 min, 4 ° C) y las muestras se diluyeron 1000 veces en acetonitrilo antes del análisis mediante UHPLC-MS utilizando un Xevo TQ-S (Waters) con ionización por electropulverización (ESI). La muestra (5 µl) se inyectó en una columna Acquity BEH/Amide UPLC (Waters, 1,7 µm, 130 Å, 2,1 mm x 50 mm) calentada a 40 °C. Se utilizó un caudal de 0,5 ml min-1, con el siguiente gradiente: 0-1,0 min a 97% B (acetonitrilo con 0,1% ácido fórmico) y 3% A (H2O con 0,1% ácido fórmico) isocrático, 1,0-4,0 min 97–30% B, 4,0–5,0 min a 30% B isocrático, 5,0–5,1 min a 30–97% B, 5,1–7,0 min a 97% B isocrático. Los productos de carbohidratos fueron detectados por ESI en modo positivo (voltaje capilar 3,10 kV; voltaje del cono 42 V; voltaje de compensación de la fuente 50 V; temperatura de desolvatación 500 °C; flujo de gas de desolvatación 1000 l h-1; flujo de gas del cono 150 l h-1; nebulizador 7,0 bar). Consulte la Información complementaria para conocer los parámetros de detección específicos de compuestos (Tabla complementaria 3). Para la cuantificación de los oligosacáridos y sus isómeros, se prepararon estándares de glucosa, maltosa (VWR), maltotriosa (Carbosynth), maltotetraosa (Carbosynth) y maltopentaosa (Carbosynth) con un rango de 0,001 a 10 μg ml-1 en acetonitrilo:agua 9:1. . Las áreas de los picos de oligosacáridos se cuantificaron utilizando la curva estándar y los datos se normalizaron con un control sin enzima para tener en cuenta la degradación del sustrato no enzimático (Waters MassLynx).

Los ensayos de inhibición del crecimiento se realizaron en una cámara anaeróbica (Coy Labs) con una atmósfera de 2,5% H2, 5% CO2 y 92,5 N2. Se inocularon bacterias a partir de colonias individuales en un caldo base de peptona y extracto de levadura (PYT, pH 7,0–7,2) que consistía en proteosa peptona (20 g l-1), extracto de levadura (10 g l-1), MgSO4 (0,008 g l-1), K2HPO4 (0,04 g l-1), KH2PO4 (0,04 g l-1), NaHCO3 (0,4 g l-1), vitamina K (0,0025 g l-1), hemina (0,005 g l-1), l-cisteína • HCl (0,25 g l-1) −1), Tween 80 (0,25 ml l−1), suero de caballo (50 ml l−1) y glucosa (2 g l−1) y se incubaron a 37 °C durante ~24 h. Los cultivos se ajustaron a una DO600 de 0,4 a 0,5, se subcultivaron a una dilución de 1:50 en PYT frescos (sin glucosa), y se agregaron los carbohidratos indicados hasta una concentración final de 2 g l-1. El glucógeno procedía de ostras (Sigma, G8751). Los ensayos se realizaron por duplicado en placas de 384 pocillos selladas con membranas permeables al gas BreathEasy (Diversified Biotech) en condiciones anaeróbicas. El crecimiento bacteriano se controló midiendo la DO600 a intervalos de 1 h durante 48 h en un lector de placas BioTek Epoch2. Los datos se normalizaron para medios blancos (no inoculados). Para los ensayos de inhibición, las bacterias se cultivaron como anteriormente, con la adición de acarbosa en las concentraciones indicadas. El grado de inhibición se determinó normalizando la DO600 para cada tratamiento con un control no tratado en el momento en que el control alcanzó la fase estacionaria, luego los valores de CI50 se calcularon usando regresión de mínimos cuadrados (GraphPad Prism 8).

Se utilizó ShortBRED para cuantificar la abundancia de las seis GDE bacterianas caracterizadas bioquímicamente en metagenomas y metatranscriptomas vaginales previamente secuenciados49. Primero, se usó ShortBRED-Identify para crear marcadores para las 6 secuencias PulA usando UniRef90 2017 como lista de referencia (archivo complementario 1) y una configuración de ID de grupo del 85 %. Se utilizaron marcadores en ShortBRED-Quantify para determinar la abundancia de genes y transcripciones de pulA en bases de datos de metagenomas y metatranscriptomas emparejados (Bioproject PRJNA797778). Los scripts utilizados para procesar los conjuntos de datos se han descrito previamente48. El resultado de ShortBRED-Quantify es lecturas por millón de lecturas por millón de kilobase (RPKM) y esto se normalizó a recuentos por genoma microbiano utilizando los tamaños promedio del genoma (AGS) de cada muestra de metagenoma, calculados utilizando MicrobeCensus60. Normalizamos el resultado de ShortBRED utilizando la ecuación derivada previamente que se muestra a continuación61.

Se utilizaron metadatos de muestra para agrupar los resultados por tipo de estado de comunidad (CST I n = 39, CST II n = 16, CST III n = 31, CST IV n = 83, CST V n = 9). La fracción de muestras positivas para un gen GDE bacteriano en un CST determinado se calculó dividiendo el número de muestras que contenían un resultado positivo (lecturas >0) por el número total de muestras con el CST correspondiente.

Las CVL se obtuvieron de la Dra. Caroline Mitchell en el Hospital General de Massachusetts (IRB: 2014P001066). Se informan todos los metadatos asociados con esta cohorte (Archivo complementario 1). Las CVL se recogieron utilizando 3 ml de solución salina estéril lavadas sobre el cuello uterino y las paredes vaginales con una pipeta de transferencia y luego se volvieron a aspirar. Las muestras se centrifugaron (10.000 x g durante 10 min a 4 °C) y los sobrenadantes se decantaron y se utilizaron en el ensayo. Las proteínas purificadas se diluyeron en tampón A (HEPES 50 mM, KCl 300 mM, glicerol al 10 %, pH 7,8) a 1 μM y luego se usaron en el ensayo. La amilasa salival humana se adquirió de Sigma Aldrich (A1031-1KU). La amilasa humana se detectó en CVL utilizando un ELISA para amilasa pancreática humana (Abcam ab137969) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La actividad de amilasa de los sobrenadantes de CVL se determinó utilizando el kit EnzCheck Ultra Amylase Assay (Thermo Fisher, E33651). El sustrato se preparó de acuerdo con las instrucciones del kit utilizando tres tampones diferentes (acetato de sodio 20 mM, CaCl2 0,5 mM, pH 4,4; acetato de sodio 20 mM, CaCl2 0,5 mM, pH 5,5; MES 20 mM, CaCl2 0,5 mM, pH 6,8). Se añadió sobrenadante de CVL (10 µl) a cada pocillo de una placa negra de 96 pocillos de fondo transparente y luego se diluyó con 40 µl de tampón de pH ajustado. Las reacciones se iniciaron con 50 μl de sustrato y se incubaron durante 30 min a 37 °C. El tampón ajustado al pH constituyó el 90% del volumen de reacción y cada reactivo del kit se disolvió en el tampón correspondiente. La fluorescencia se midió a 485/528 nm. Las tasas iniciales se calcularon en el software lector de placas (Biotek) determinando la pendiente más alta que cubría al menos 5 puntos de datos.

Se recolectaron muestras de FVC de filiales de la Universidad de Seattle (IRB: FY2022‐002). Los participantes no recibieron compensación por su inclusión en el estudio. Todos los metadatos se informan en Información complementaria (Tabla complementaria 4). Los donantes recogieron ellos mismos una muestra insertando un disco blando y luego esperando de 1 a 4 h antes de retirar el disco y colocarlo en un vial cónico de 50 ml. Dentro de 1 h de la recolección, el CVF se eliminó del disco mediante la adición de 1 ml de PBS y la centrifugación a 200 x g durante 8 minutos. Luego las muestras se congelaron en alícuotas de 0,1 ml a -70 °C.

El Dr. Hermann Overkleeft y el Dr. Gideon Davies (Universidad de Leiden) proporcionaron amablemente sondas biotiniladas y fluorescentes para α-amilasas (CYR1114 y CYR232, respectivamente)26 y α-glucosidasas (JJB384 y JJB383, respectivamente). Antes de su uso, las muestras de CVF se centrifugaron (10.000 × g durante 5 minutos) para eliminar las mucinas. Las muestras de CVF se normalizaron a una concentración de proteína (ensayo de ácido bicinconínico) de 1 mg ml-1 utilizando PBS estéril y se añadió un cóctel inhibidor de proteasa sin EDTA (Roche). Luego se incubó el sobrenadante de CVF con la sonda fluorescente de amilasa a una concentración final de 25 µM o la sonda fluorescente de glucosidasa a una concentración final de 10 µM. Se incluyeron controles negativos de vehículo (1% v/v de dimetilsulfóxido en agua) y controles de choque térmico para identificar la fluorescencia de fondo o el etiquetado fuera del objetivo. Las muestras se incubaron durante 4 h a 37 °C. Luego se separaron las proteínas en un gel PAGE al 4-20% (Bio-Rad) y se visualizó la fluorescencia de la sonda (Azure C600).

Las amilasas activas se enriquecieron utilizando ABPP y se identificaron mediante LC-MS/MS como se describió anteriormente, con ligeras modificaciones50. El sobrenadante de CVF preparado como anteriormente se dividió en tres alícuotas de 400 µl. Se añadió sonda de amilasa biotinilada (concentración final 25 μM), sonda de glucosidasa biotinilada (concentración final 10 μM) o un volumen igual de vehículo (dimetilsulfóxido al 1% en agua) y las muestras se incubaron durante 4 h a 37 °C. Después del etiquetado, se agregaron 400 µl de metanol helado y las muestras se almacenaron a -70 °C durante la noche para precipitar las proteínas. La proteína precipitada se recogió mediante centrifugación (10.000 x g durante 10 min), se redisolvió en 500 µl de SDS al 1,2% en PBS y se calentó a 95 °C durante 2 min. Luego, las muestras se centrifugaron (14.000 x g durante 5 minutos) para eliminar las proteínas insolubles.

Se preparó resina de agarosa estreptavidina (100 µl, Thermo Fisher) lavando con SDS al 0,5% p/v en PBS (3x), urea 6 M en NH4HCO3 25 mM (3x) y PBS (3x) usando un colector de vacío. Luego se añadió resina lavada en 2 ml de PBS a las muestras de proteínas y las muestras se incubaron, rotando a 37 °C durante 1 h. Luego, las muestras se transfirieron a columnas (Bio-Rad Poly-Prep) en un colector de vacío y se lavaron con volúmenes de 1 ml de SDS al 0,5% p/v en PBS (3x), urea 6 M en NH4HCO3 25 mM (3x), agua ultrapura (3×), PBS (9×) y NH4HCO3 25 mM (5×). Luego se transfirió la resina en urea 6 M en NH4HCO3 25 mM a tubos Eppendorf de baja unión y se redujo con DTT 5 mM a 37 °C durante 30 min, seguido de alquilación con yodoacetamida 10 mM a 50 °C durante 1 h. Las muestras se lavaron con PBS (9x) y NH4HCO3 25 mM (5x). Luego se transfirió la resina a nuevos tubos Eppendorf de baja unión, se resuspendió en 200 µl de NH4HCO3 25 mM y se agregaron 0,4 µl, 0,25 µg µl-1 de tripsina (Promega, grado proteómico) en HEPES 25 mM. Las muestras se incubaron durante la noche a 37 °C con rotación. Se recogieron los sobrenadantes seguido de un lavado de resina adicional con 150 µl de NH4HCO3 25 mM, que se añadió al sobrenadante original. Luego, los péptidos se secaron (Speed-vac) antes de realizar más análisis.

A excepción de S010, el análisis LC-MS/MS se realizó con un nLC Thermo Scientific Easy1200 (Thermo Scientific) acoplado a un espectrómetro de masas tribrido Orbitrap Eclipse (Thermo Scientific). La desalación en línea se logró utilizando una columna trampa de fase inversa (100 μm × 20 mm) empaquetada con Magic C18AQ (resina de 5 μm 200 Å; Michrom Bioresources), seguida de separaciones de péptidos en una columna de fase inversa (75 μm × 270 mm) empaquetado con ReproSil-Pur C18AQ (resina de 3 μm 120 Å; Dr. Maisch) montado directamente en la fuente de iones de electropulverización. Un gradiente de 60 minutos utilizando un sistema de dos fases móviles consistió en 0,1% de ácido fórmico en agua (A) y 80% de acetonitrilo en 0,1% de ácido fórmico en agua (B). La separación cromatográfica se logró en un gradiente de 60 min de 8 a 30 % de B durante 57 min, de 30 a 45 % de B durante 10 min, de 45 a 60 % de B durante 3 min, de 60 a 95 % de B durante 2 min y se mantuvo a 95 % B durante 11 min a un caudal de 300 nl min-1. Se aplicó un voltaje de pulverización de 2300 V a la punta de electropulverización en línea con una fuente FAIMS utilizando voltajes de compensación variados de –40, –60 y –80 mientras el instrumento Orbitrap Eclipse se operaba en el modo dependiente de datos, los escaneos de estudio MS estaban en el Orbitrap (valor objetivo de AGC normalizado del 300 %, resolución 240.000 y tiempo máximo de inyección de 50 ms) con un tiempo de ciclo de 1 s, y la adquisición de espectros MS/MS se detectaron en la trampa de iones lineal (valor objetivo de AGC normalizado del 50 % y tiempo de inyección 35 ms) usando activación HCD con una energía de colisión normalizada del 27%. Los iones seleccionados se excluyeron dinámicamente durante 60 s después de un recuento repetido de 1. Para S010, las muestras de péptidos se disolvieron en acetonitrilo al 2 % en ácido fórmico al 0,1 % (20 µl) y se analizaron (18 µl) mediante LC/ESI MS/MS con un Thermo Scientific Easy-nLC 1000 (Thermo Scientific) acoplado a un espectrómetro de masas tribrido Orbitrap Fusion (Thermo Scientific). La desalinización en línea se logró utilizando una columna trampa de fase inversa (100 μm × 20 mm) empaquetada con Magic C18AQ (resina de 5 μm 200 Å; Michrom Bioresources), seguida de separaciones de péptidos en una columna de fase inversa (75 μm × 250 mm) empaquetado con ReproSil-Pur 120 C18AQ (resina Dr Maisch de 3 μm 120 Å) montado directamente en la fuente de iones de electropulverización. Para las separaciones cromatográficas se utilizó un gradiente de 90 minutos de 2% a 35% de acetonitrilo en ácido fórmico al 0,1% a un caudal de 300 nl min-1. Se aplicó un voltaje de pulverización de 2200 V a la punta de electropulverización y el instrumento Orbitrap Fusion se operó en el modo dependiente de datos, los escaneos de estudio MS se realizaron en el Orbitrap (valor objetivo de AGC 500 000, resolución 120 000 y tiempo de inyección 50 ms) con un 3 El tiempo de ciclo y la adquisición de espectros MS/MS se detectaron en la trampa de iones lineal (valor objetivo de AGC de 10 000 y tiempo de inyección de 35 ms) utilizando la activación de HCD con una energía de colisión normalizada del 27 %. Los iones seleccionados se excluyeron dinámicamente durante 20 s después de un conteo repetido de 1.

Las muestras se analizaron con FragPipe IonQuant habilitado63,64,65,66. Los espectros se compararon con una base de datos que contenía proteínas de referencia humanas UniProt; proteínas UniRef90 para L. crispatus, L. iners, L. gasseri, L. jensenii, G. vaginalis, A. vaginae, P. bivia y M. mueleris; contaminantes comunes; y secuencias de proteínas inversas como señuelos para la estimación de la tasa de descubrimiento falso (FDR) (consultado el 25 de mayo de 2022). Los datos sin procesar están disponibles en el Archivo complementario 1. Los datos de abundancia se analizaron utilizando Perseus67. Los datos de abundancia se transformaron log2 y se normalizaron mediante ajuste de ancho. Para S010, se promediaron los grupos de proteínas presentes en dos de tres réplicas y se combinaron las tablas de datos. Se buscaron dominios CAZyme utilizando dbCAN 2 ( referencia 68).

Se añadió líquido CVF (5 µl, no centrifugado) a 95 µl de 10 mg ml-1 de pululano (Megazyme) en tampón de reacción. Las mezclas de reacción se incubaron a 37 °C y se tomaron los puntos de tiempo a las 3, 5, 8 y 24 h diluyendo 100 veces en acetonitrilo:agua 9:1. Las muestras se diluyeron aún más 1000 veces en acetonitrilo y se analizaron mediante LC-MS como se describe anteriormente. Las muestras se normalizaron con respecto a un control sin enzima.

El efecto inhibidor de un panel de cuatro inhibidores de moléculas pequeñas se determinó utilizando una modificación del ensayo de actividad de amilasa en CVL utilizado anteriormente. Para la selección inicial, las enzimas se preincubaron con acarbosa 1 mM (Abcam), acarviosina (Toronto Research Products), voglibosa (Spectrum Chemical) o miglitol (Tokyo Chemical) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Para el análisis de IC50, se preincubó la enzima (2,5–50 nM) con acarbosa en un rango de 0,366 μM a 3000 μM en un volumen total de 50 μl. Las reacciones se iniciaron con 50 μl de sustrato y se incubaron durante 30 min a 37 °C, monitoreando la fluorescencia a 485/528 nm. Las tasas iniciales se calcularon determinando la pendiente más alta que cubría al menos 8 puntos de datos. El porcentaje de actividad se calculó normalizando la actividad a un control sin inhibidor. Los valores de CI50 se calcularon mediante un ajuste no lineal de los datos a la función de respuesta inhibidora versus normalizada (GraphPad Prism 8). El error asociado con los valores de IC50 representa intervalos de confianza del 95%.

No se utilizó ningún método estadístico para predeterminar el tamaño de la muestra para ninguna de las comparaciones estadísticas. Sin embargo, el tamaño de nuestra muestra fue similar al de trabajos anteriores sobre este tema21. Para todas las pruebas estadísticas, se supuso que la distribución de los datos era normal, pero esto no se probó formalmente. La aleatorización no fue relevante para este estudio porque no ubicamos a los participantes en grupos. Se utilizó una prueba de RUTA para identificar y eliminar valores atípicos en el análisis de actividad de las muestras de CVL (Datos ampliados, figura 8). Los investigadores que realizaron el análisis de actividad de las muestras clínicas no conocían los metadatos durante el transcurso del estudio.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

El número de identificación de proteínas en la base de datos del NCBI para cada enzima caracterizada es el siguiente: L. crispatus PulA (EEU28204.2), L. iners PulA (EFQ51965.1), G. vaginalis PulA (EPI56559.1), M. mulieris PulA (EEZ90738.1), P. bivia PulA (WP_061450340.1), P. bivia GH13 (WP_036862728.1). El genoma de L. crispatus C0176A1 (PulA-) se puede encontrar con el número de acceso JAEDCG000000000. Los conjuntos de datos metagenómicos y metatranscriptómicos utilizados en este estudio se pueden encontrar en Bioproject PRJNA797778. Se puede acceder a los datos proteómicos de este estudio en la base de datos PRIDE utilizando el código de acceso PXD042917. Las anotaciones de los dominios de proteínas provienen de las bases de datos Pfam y CAZy. Todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en un repositorio de datos en synapse.org y se puede acceder a ellos en https://www.synapse.org/#!Synapse:syn51422003. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a A. Woo por su ayuda en la clonación de varios de los homólogos bacterianos de PulA, a B. Fu por la lectura crítica del manuscrito y a A. Bergerat-Thompson del Hospital General de Massachusetts por proporcionar muestras de CVL; H. Overkleeft (Universidad de Leiden) y G. Davies (Universidad de York) por el generoso obsequio de las sondas ABPP; a todos los miembros del Consorcio de Investigación del Microbioma Vaginal de la Fundación Bill y Melinda Gates por las útiles conversaciones sobre el trabajo; los participantes del estudio por la donación de muestras de CVL y CVF; y D. Relman (Universidad de Stanford) por el obsequio de L. crispatus C0176A1. El apoyo financiero para este estudio fue proporcionado por la Fundación Bill y Melinda Gates (número de premio OPP1189211 a EPB). El recurso compartido de proteómica y metabolómica del Consorcio contra el Cáncer Fred Hutch/Universidad de Washington (número de concesión P30 CA05704 a CW) proporcionó apoyo adicional. EPB es investigador del Instituto Médico Howard Hughes. MIH-P. recibió apoyo como miembro del Programa de Desarrollo de Científicos Pediátricos (Premio No. HD000850) del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano Eunice Kennedy Shriver y a través de una Beca de Médico Científico de la Doris Duke Charitable Foundation (Subvención No. 2019129). SR-N. fue apoyado por un premio a la carrera para científicos médicos del Fondo Burroughs Wellcome, una beca biomédica Pew, un premio Basil O'Connor Starter Scholar de March of Dimes (1K08AI130392-01) y por NIGMS/NIH (premio DP2GM136652). CW, AKN y MQP contaron con el apoyo de MJ Murdock Charitable Trust (premio NS‐201913756) y la Facultad de Ciencias e Ingeniería de la Universidad de Seattle. PP contó con el apoyo de la Beca de Investigación para Graduados de la Fundación Nacional de Ciencias (NSF-GRFP). MTF y JR contaron con el apoyo de la Fundación Bill y Melinda Gates (Premio No. OPP1189217).

Estos autores contribuyeron igualmente: Dominick J. Jenkins, Benjamin M. Woolston.

Departamento de Química y Biología Química, Universidad de Harvard, Cambridge, MA, EE. UU.

Dominick J. Jenkins, Benjamin M. Woolston, Paula Pelayo y Emily P. Balskus

Departamento de Ingeniería Química, Northeastern University, Boston, MA, EE. UU.

Benjamín M. Woolston

División de Enfermedades Infecciosas y División de Gastroenterología, Departamento de Pediatría, Boston Children's Hospital, Boston, MA, EE. UU.

M. Indriati Hood-Pishchany y Seth Rakoff-Nahoum

Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

M. Indriati Hood-Pishchany y Seth Rakoff-Nahoum

Departamento de Química, Universidad de Seattle, Seattle, WA, EE. UU.

Alyssa N. Konopaski, M. Quinn Peters y Christopher Whidbey

Instituto de Ciencias del Genoma, Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland, Baltimore, MD, EE. UU.

Michael T. Francia y Jacques Ravel

Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland, Baltimore, MD, EE. UU.

Michael T. Francia y Jacques Ravel

Centro Vincent de Biología Reproductiva, Hospital General de Massachusetts, Boston, MA, EE. UU.

Carolina M. Mitchell

Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

Carolina M. Mitchell

Instituto Médico Howard Hughes, Universidad de Harvard, Cambridge, MA, EE. UU.

Emily P. Balskus

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EPB, BMW, SR-N. y MIH-P. concibió el estudio. DJJ y BMW diseñaron y llevaron a cabo experimentos de purificación de enzimas y caracterización bioquímica. EPB, DJJ, BMW, CW, SR-N. y MIH-P. escribió el manuscrito. DJJ y MIH diseñaron y realizaron experimentos de crecimiento bacteriano. CW, ANK y MQP diseñaron y realizaron experimentos ABPP. DJJ, PP y EPB diseñaron análisis bioinformáticos de datos metagenómicos y metatranscriptómicos. PP realizó un análisis bioinformático de datos de secuenciación multiómica. MTF y JR ayudaron con el acceso, análisis e interpretación de los datos metagenómicos y metatranscriptómicos. CMM proporcionó muestras de CVL y los metadatos correspondientes. Todos los autores contribuyeron a la interpretación de los datos, participaron en la revisión del manuscrito y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Seth Rakoff-Nahoum, Christopher Whidbey o Emily P. Balskus.

CMM se ha desempeñado como consultor para Scynexis Inc, Ferring Pharmaceuticals y ha recibido financiación para investigación de Scynexis, Inc. JR es cofundador de LUCA Biologics, una empresa de biotecnología que se centra en traducir la investigación del microbioma en fármacos bioterapéuticos vivos para la salud de la mujer. Los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

Nature Microbiology agradece a Nicole Koropatkin y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Se cargaron 2 µg de proteína purificada en un gel de página SDS Biorad (2-14% Bis-Tris). De izquierda a derecha, Precision Plus Protein All Blue Standards (BioRad); L. crispatus PulA, 137 kD; L. iners PulA, 192 kD; M. mulieris PulA, 151 kD; G. vaginalis PulA, 219 kD; P. bivia GH 13, 70,4 kD; P. bivia PulA, 72,8 kD; Precision Plus Protein All Blue Standards (BioRad). En EXPASY se predijeron los pesos moleculares de proteínas expresadas de forma heteróloga. Este experimento se repitió dos veces demostrando resultados similares (n = 2).

Datos fuente

a. Crecimiento de L. crispatus C0176A1 (pulA—) que contiene todos los controles relevantes para los ensayos de complementación de proteínas b. Crecimiento de L. crispatus MV-1A-US (pulA+) que contiene todos los controles relevantes para los ensayos de complementación de proteínas. Las condiciones de glucógeno, maltosa y glucosa se derivan de los mismos datos en todos los gráficos de cada panel. Todos los datos de crecimiento constan de tres experimentos independientes realizados durante tres días (n = 3).

Datos fuente

a. Análisis cinético de Michaelis-Menten para ensayos con glucógeno. b. Análisis cinético de Michaelis-Menten para ensayos con pululano c. Análisis cinético de Michaelis-Menten para ensayos con amilosa. Todos los datos son representativos de tres réplicas experimentales realizadas durante dos días. El ajuste no lineal se realizó en Graphpad Prism 8.

Datos fuente

a. Se cargaron 2 µg de mutantes del sitio activo y G. vaginalis PulA de tipo salvaje en un gel de página SDS Biorad (2-14 % Bis-Tris). Este experimento se repitió dos veces demostrando resultados similares (n = 2). b. Actividad específica de mutantes del sitio activo sobre el glucógeno. El gráfico insertado muestra datos de actividad específicos para mutantes de G. vaginalis. ∆AS1, ∆AS2 y ∆DBL representan D233A, D1317A y ambas mutaciones respectivamente. Los datos son representativos de tres réplicas experimentales durante dos días. Las barras de error representan una desviación estándar por encima y por debajo de la media.

Datos fuente

Se colocó 1 µl de cada estándar (10 mg/ml) y mezcla de reacción enzimática en una placa de TLC (20 cm por 20 cm, gel de sílice Analtech HLF). La TLC se realizó durante aproximadamente 5 h en butanol: ácido acético: agua 3:2:1 y se tiñó con ácido sulfúrico: etanol 1:19. Estos resultados son representativos de dos ensayos que muestran hallazgos similares (n = 2).

a. Efectos de inhibidores de amilasa conocidos (1 mM) sobre las actividades de GDE purificadas hacia un sustrato de almidón fluorescente BODIPY (n = 1). b. Actividad inhibidora de la acarbosa hacia amilasas extracelulares purificadas. Se usó un sustrato de almidón fluorescente BODIPY y la actividad se normalizó a un control sin inhibidor. Los datos son representativos de tres réplicas experimentales durante dos días. C. Las bacterias se cultivaron en presencia de las concentraciones indicadas de acarbosa en medios que contenían glucosa, maltosa o glucógeno como fuente principal de carbohidratos. El crecimiento en presencia de inhibidor se normalizó con respecto al control no tratado. Los valores de CI50 se calcularon utilizando una regresión de mínimos cuadrados de los valores normalizados. ND (no determinado) se indica cuando el ajuste de la curva resultante fue deficiente y no se pudo determinar con seguridad un valor de IC50, o la inhibición general del crecimiento fue inferior al 10 %. Los datos son representativos de al menos dos réplicas biológicas realizadas durante dos días.

Datos fuente

% Positivo representa el porcentaje de muestras que contenían lecturas asignadas a nuestras proteínas de consulta (lecturas > 0). El tamaño de la muestra es el siguiente: CST I, n = 39; CCT II, ​​n = 16; CCT III, n = 31; CCT IV, n = 83; CST V, n = 9.

Datos fuente

Los valores atípicos se determinaron y eliminaron mediante una prueba ROUT. Se utilizó una prueba de Pearson de dos colas para determinar la correlación (pH 4,4, r = 0,8556, IC 95% 0,6472 a 0,9450, p <0,0001; pH 5,5, r = 0,9611, IC 95% 0,8966 a 0,9857, p <0,0001; pH 6,8 , r = 0,9713, IC del 95 %: 0,9252 a 0,9891, p <0,0001) Los datos de actividad representan la media de tres experimentos durante dos días y la detección ELISA es la media de dos experimentos durante dos días. Las barras de error representan una desviación estándar por encima y por debajo de la media.

Datos fuente

Los recuentos espectrales indican la suma de los espectros totales asignables a una proteína en las seis muestras individuales. Abreviaturas: Li PulA, L. iners PulA; Lc PulA, L. crispatus PulA; Gv AmyA, G. vaginalis AmyA; GAA, α-glucosidasa lisosomal humana; AMY1, amilasa salival humana; SP, péptido señal; SlpA, proteína A de la capa superficial; GH, dominio de glucósido hidrolasa; PUD, dominio asociado a pululanasa bacteriana; CBM, módulo de unión a carbohidratos.

Los puntos temporales de las reacciones CVF se eliminaron y congelaron a las 3, 5, 8 y 24 horas. Estos datos se derivan de tres réplicas experimentales durante dos días.

Datos fuente

Higos suplementarios. 1 a 5 y tablas 1 a 4.

Datos de fuente estadística.

Datos de fuente estadística.

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Gel SDS-PAGE sin procesar.

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Reimpresiones y permisos

Jenkins, DJ, Woolston, BM, Hood-Pishchany, MI et al. Las amilasas bacterianas permiten la degradación del glucógeno por parte del microbioma vaginal. Nat Microbiol 8, 1641-1652 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01447-2

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Recibido: 08 de julio de 2021

Aceptado: 11 de julio de 2023

Publicado: 10 de agosto de 2023

Fecha de emisión: septiembre de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01447-2

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